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Exercices de chromatographie :


Exercice 16 : Marquage radioactif d'une sonde nucléotidique :

Lors du criblage d'une banque (d'ADNc ou génomique) ou de la réalisation d'un northern blot, southern blot, ou pour des expériences d'hybridation in situ, il est nécessaire de réaliser une sonde nucléotidique radiomarquée au 32P.

Le marquage d'une séquence d'ADN est réalisé par la technique de "random-priming" (multi-amorçage au hasard) qui utilise un mélange de courts oligonucléotides (6 à 9 nucléotides) comportant une combinaison de toutes les séquences possibles.

Le marquage radioactif (incorporation d'ATP marqué par le 32P) s'effectue après dénaturation de la séquence d'ADN double brin qui va être utilisée comme matrice, et appariement du mélange de courts oligonucléotides.

L'enzyme T4 ADN polymérase va permettre la polymérisation en 5' des amorces, dans le sens 5' vers 3'.

La séquence d'ADN est incubée 30 min à 37 °C en présence de 32P déoxy-ATP.et des 3 autres nucléotides (dCTP, dGTP, dTTP) non radiomarqués. Ceci conduit à la synthèse d'un mélange d'amorces radiomarquées de quelques centaines de nucléotides de long.


Le mélange réactionnel ainsi obtenu est chargé sur une colonne de Séphadex G-50, des fractions de 100 ml sont recueillies et la radioactivité est comptée ( voir tableau ci-après).



Fraction cpm/ml
1 100
2 150
3 700
4 1000
5 630
6 140
7 480
8 1200
9 1500
10 1300
11 750
12 470
13 130

Schéma tiré de : Biologie moléculaire et médecine - JC. Kaplan, M. Delpech - Médecine-Sciences Flammarion.


Questions :

1 - Quel est le type de chromatographie employé ici ? Donner son principe (une demi-page).

2 - Tracer le diagramme exprimant la radioactivité en fonction du n° de fraction. A quoi correspond le premier pic de radioactivité ? A quoi correspond le second pic ? Quelle(s) fraction(s) allez vous récupérer afin de vous en servir comme sonde radiomarquée ?

3 - Quel est le volume mort de la colonne ?

Correction


1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 - 9 - 10 - 11 - 12 - 13 - 14 - 15 - 16 - 17


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