Exercice 17 :
L'expression d'une protéine dans une bactérie (
Escherichia coli le plus souvent) permet l'obtention d'un taux élevé de protéines pures. Le plasmide pET-15 de la société Novagen permet l'expression inductible de protéines recombinantes porteuses d'une extension N-terminale de 6 résidus histidine (His).
Cette séquence poly-His est capable de se lier à des ions nickel divalents (Ni
2+) immobilisés sur un gel de cellulose ou d'agarose. Un extrait bactérien brut, après induction de l'expression de la protéine recombinante, peut être chargé directement sur une colonne contenant ce type de résine, et après une étape de lavage, la protéine retenue peut être éluée par de l'imidazole. Cette résine peut être régénérée et réutilisée.
La figure représente un gel SDS-PAGE coloré par le bleu de Coomassie, où l'on a séparé les échantillons suivants :
1 - Lysat brut de bactéries transfectées par le plasmide pET-15 contenant un insert d'ADNc
2 - Protéines non retenues sur la colonne
3 - Lavage
4 - Protéine éluée
Questions :
1 - Quel est le type de chromatographie utilisé ? Expliquer le principe en une demi-page.
2 - Commenter le gel SDS-PAGE. Déterminer la masse moléculaire de la protéine éluée.
1 -
2 -
3 -
4 -
5 -
6 -
7 -
8 -
9 -
10 -
11 -
12 -
13 -
14 -
15 -
16 -
17
