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Exercices de chromatographie :


Examen 1 :
DEUG SVTE (deuxième année) - option Biochimie Expérimentale - Université d'Aix-Marseille I - Juin 1999.
Durée conseillée : 30 minutes - 1 heure.

Une enzyme de masse moléculaire 70000, présente dans le cerveau de rat, est purifiée en deux étapes de chromatographie, à partir d'un extrait brut de 25 g de protéines. Cet extrait présente une activité enzymatique spécifique de 400 UE / g de protéines.

- Etape 1 :
La première étape consiste en une chromatographie d'exclusion sur colonne : les 25 g de protéines sont repris dans un tampon à pH 7,4 puis déposés sur la colonne à un temps zéro. A partir de ce moment, on recueille en sortie de colonne des fractions éluées de 5 ml dans lesquelles on dose l'activité enzymatique. Le résultat des dosages est donné ci-dessous, ainsi que la concentration protéique de chaque fraction :

n de la fraction : AE (UE/ml) : concentration protéique (mg/ml) :
1 4 420
2 37 540
3 328 480
4 1256 570
5 216 420
6 23 280
7 2 250

AE : activité enzymatique. UE : nombre d'unités enzymatiques.


Les trois fractions contenant majoritairement l'enzyme d'intérêt sont recueillies et mélangées.

- Etape 2 :
Le mélange des trois fractions (pH 7,4) est déposé sur une colonne contenant une résine échangeuse d'ions, qui va permettre la deuxième étape de purification de l'enzyme (pHi de l'enzyme = 9,6). Au cours de l'élution, des fractions de 5 ml sont récoltées et l'activité enzymatique est dosée dans chacune de ces fractions (voir tableau ci-après).

n de la fraction : AE (UE/ml) :
1 1
2 3
3 2
4 2
5 8
6 982
7 12

La fraction n 6 est récupérée et la densité optique à 260 nm est mesurée sur cette fraction : DO260 nm = 0,740. La valeur du coefficient d'extinction molaire pour l'enzyme est : e = 115 M-1 . cm-1. La longueur de la cuve est 1 cm. (On considérera pour les calculs que l'enzyme est pure.)

Vous répondrez aux questions sur la feuille suivante, que vous mettrez dans votre copie d'examen.


Correction




Nom : .............................. Prénom : .............................................


Questions :

1 - A l'issue de la chromatographie d'exclusion (étape 1), quelles sont les trois fractions que l'on mélange ? Calculer le nombre total d'UE recueilli, ainsi que la quantité totale de protéines. Quel est le volume d'élution de l'enzyme ?

- Fractions :

- Nombre total d'UE recueilli :

- Quantité totale de protéines :

- Volume d'élution :



2 - Quel est le type d'ion que peut échanger la résine de l'étape 2 ? Justifier la réponse. Donner un exemple de groupement chimique pour une telle résine.

- Type d'échangeur d'ions :

- Exemple de groupement :



3 - A quel pH va être réalisée l'élution pour la chromatographie échangeuse d'ions ? Justifier la réponse. Quel est le volume d'élution de l'enzyme ?



- Volume d'élution :


4 - Déterminer le rendement de chacune des 2 étapes de purification, ainsi que le rendement global.


5 - Calculer la quantité de protéines récupérée après l'étape 2 (chromatographie d'échange d'ions). Quel est le taux de purification de l'enzyme à l'issue de chaque étape chromatographique ? Conclusion ?

(pour répondre aux questions 4 et 5, remplir le tableau ci-dessous :)

  protéines (g) : AE (UE) : rendement : taux de purification :
extrait :        
étape 1 :        
étape 2 :        


- Rendement global :

- Conclusion (utiliser le verso de la feuille, si nécessaire).



Correction


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