1 - Expériences de saturation de la liaison à l'équilibre - Notions de Kd et de Bmax :
Principe :
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Il s'agit de mesurer la liaison spécifique à l'équilibre, lors de l'incubation de concentrations croissantes de ligand radioactif (par ex. : 10-12 à 10-5 M), avec une quantité fixe de récepteur (par exemple : 100000 cellules entières exprimant des récepteurs, ou bien 10 mg d'une préparation de membranes cellulaires).
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Notion de liaison spécifique :
un radioligand L* est capable de se lier à des sites de liaison spécifiques et non-spécifiques.
Figure 1 : à gauche : représentation de la liaison en fonction de la concentration initiale en ligand ;
à droite : représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration initiale en ligand.
Représentation graphique des expériences de saturation de la liaison :
Rappel : la liaison spécifique à l'équilibre, à une concentration donnée de radioligand est égale à la fraction de récepteurs occupés multipliée par le B max (B max = capacité maximale de liaison).
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Équation 2
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[RL] = [RL*] = concentration de radioligand lié de manière spécifique
- [L] = [L*] = concentration de radioligand libre.
Ainsi, la représentation de [RL] (axe des ordonnées, y) en fonction de [L] (axe des abcisses, x) est une hyperbole :
Figure 2 : [RL] = f ( [L] )
Unités :
- Axe des x et des y : même unité : cpm ; nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines.
- Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou pM.
- Le Bmax s'exprime en nombre de sites de liaison/cellule ou en fmol/mg de protéines.
Représentation des résultats selon Scatchard :
Figure 3 : Représentation selon Scatchard : B/F = f (B).
- L'axe des x représente la liaison spécifique B (" Bound ").
- L'axe des y représente la liaison spécifique divisée par la concentration en ligand libre B/F (F, " Free ")
La représentation selon Scatchard permet de déterminer le Kd et le Bmax :
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Kd = moins l'inverse de la pente
- Bmax = intersection de la droite, avec l'axe des x
Unités pouvant être employées pour les valeurs de l'axe des x et des y :
- cas 1 :
- Axe des x = en nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines.
- Axe des y : B en cpm ; F en cpm ; B/F : sans unité.
Dans ce cas :
- B/F représente donc la fraction de radioligand liée au récepteur.
- Kd = accessible après conversion.
- Bmax = accessible directement.
- cas 2 :
- Axe des x = en nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines.
- Axe des y = en nombre de sites / cellule / nM ; fmol / mg de protéines / nM.
Dans ce cas :
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La pente s'exprime en nM-1 ; donc le Kd est directement accessible en nM.
- Bmax = accessible directement.
Cas particulier : Représentation de Scatchard non linéaire.
En résumé :
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