2 - Expériences de déplacement de la liaison à l'équilibre - Notions d'IC₅₀ et de Ki :

Principe :

C'est la mesure de la liaison spécifique à l'équilibre, d'une concentration donnée (en général égale au Kd) en ligand radiomarqué en présence d'une concentration variable et croissante de ligand froid (par ex. : 10-12 à 10-5 M). Le ligand froid entre en compétition avec le ligand radioactif pour sa liaison au récepteur, c'est pourquoi on peut parler de compétition de la liaison à l'équilibre

Cette technique permet :

• de démontrer qu'un ligand froid, se lie à un récepteur.
• d'étudier la liaison d'un ligand de faible affinité pour un récepteur (il est plus facile de disposer d'un ligand froid en grande quantité, que d'un ligand radiomarqué)

Représentation des résultats :



Figure 1 : Représentation de la liaison totale en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid.

Axe des y : cpm ; nombre de sites / cellule ; fmol / mg de protéines.

NB : la liaison totale n'est pas égale au B_max car la concentration en radioligand n'est pas saturante.


Expériences de compétition de la liaison, à l'équilibre ( IC₅₀ , K_i ) :

La représentation graphique la plus courante est la suivante :



Figure 2 : Représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid.

• 100 % : liaison spécifique en l'absence de compétiteur froid. 
• 50 % : concentration en compétiteur froid qui déplace 50 % de la liaison spécifique en ligand radiomarqué ( = IC₅₀).
• 0 % : liaison spécifique en présence d'un excès de compétiteur froid.

En théorie, l'on doit passer de 10 % à 90 % de liaison spécifique en moins de 2 unités log de concentration.


Equation de Cheng et Prusoff :

Cheng et Prusoff ont déterminé en 1973 la relation qu'il existe entre le K_d, le K_i et l'IC₅₀ (Cheng Y. and WH. Prusoff, Biochem. Pharmacol. (1973) 22, 3099-3108).

• K_i = constante de dissociation à l'équilibre pour le compétiteur froid.
  
• K_d = constante de dissociation à l'équilibre pour le ligand radiomarqué (affinité).
  
• [L] = [L*] = concentration de radioligand libre.

K_d représente donc bien la concentration en compétiteur froid qui se lie à 50 % des sites récepteurs.