B - Le marquage fluorescent :

B.1 - Introduction sur le marquage fluorescent :
Les groupements fluorescents sont aussi appelés fluorophores.
La fluorescence est une voie alternative qui offre de nombreux avantages dont surtout l’absence d’exposition à des rayonnements pour les manipulateurs.
La microscopie confocale (coupes optiques de cellules) permet de visualiser les peptides fluorescents liés sur des cellules

Site de fixation du fluorophore sur le peptide :
On peut séparer les fluorophores en deux groupes, en fonction de leur groupement réactif :

• Les groupements réactifs sur les amines (peptides, protéines, oligonucléotides)
  
• [ Les groupements réactifs sur les thiols (protéines) ]

NB : On ne parlera ici que des groupements réactifs sur les amines.

Le complexe peptide-fluorophore doit demeurer hydrophile, ce qui est particulièrement important pour déterminer la localisation des récepteur cellulaires de surface.
La taille et la nature du fluorophore vont influer directement sur l’encombrement stérique et l’hydrophobicité de la molécule (modification de l’affinité pour le récepteur)

De nombreux fluorophores sont disponibles commercialement :

• La Fluorescéïne
  
• Le Vert Oregon
  
• La Rhodamine
  
• Le Rouge Texas
  
• Le Bodipy
  
• La Cyanine et ses dérivés (Cy 3.5)

Toutes ces molécules et leur dérivés vont modifier les fonctions amines des peptides ou des protéines.


Exemple 1 : La fluorescéïne et ses dérivés :
La fluorescéïne permet d'obtenir un marquage fluorescent vert.

Avantages de ce fluorophore :

• Il présente une absorbance relativement élevée
  
• Le rendement quantique de fluorescence est excellent
  
• Sa solubilité est bonne dans l’eau
  
• La longueur d'onde d’absorption (494 nm) en fait un fluorophore de choix pour la microscopie confocale et la cytométrie de flux
  
• Il est peu sujet à la précipitation.

Inconvénients de ce fluorophore :

• Fluorescence sensible au pH entre 5 et 8
• Quenching (extinction de la fluorescence) important lors de conjugaison avec des biopolymères.         

Parmi les dérivés de la fluorescéïne, les isothiocyanates de fluorescéïne (FITC) sont les plus répandus.


Exemple 2 : Les composés de type Bodipy :
- Bodipy rouge : le Bodipy 576/589 (Molecular Probes)
- Bodipy vert : le Bodipy 503/512 (Molecular Probes)


Exemple 3 : Le Cy 3.5 :
Le Cy 3.5 est un dérivé de la cyanine qui réagit comme les dérivés Bodipy et peut être utilisé à la place du Bodipy Rouge 576/589.

B.2 - Utilisation des peptides fluorescents :

B.2.1 - En remplacement du ligand radioactif dans les expériences de liaison :
Dans ce cas, il y a deux techniques pour mesurer l'association du ligand fluorescent avec son récepteur :

• mesure de la fluorescence émise, par un fluorimètre.
  
• mesure de la fluorescence émise, par polarisation de la fluorescence : le ligand lié étant moins mobile que le ligand libre, la polarisation permet de lire les résultats sans avoir à séparer le lié du libre.

Pour une étude cinétique de la liaison : le suivi de la cinétique sera effectué en temps réel, en lecture continue.

B.2.2 - Dans des études de cytométrie de flux :
La cytométrie de flux permet le tri des populations de cellules en suspension qui ont été marquées à l'aide d'un ligand ou d'un anticorps fluorescent.

B.2.3 - En microscopie en fluorescence :
Les peptides fluorescents permettent l’acquisition d’images plus rapidement et avec une plus grande résolution que les peptides radiomarqués (autoradiographie in vitro). La microscopie confocale permet une très bonne résolution des images acquises (et ce sur cellules en culture, coupes fines d’organes, etc).

Cette technique de microscopie est ainsi utilisées pour l'étude de la liaison de ligands fluorescents à leurs récepteurs et de l’internalisation du complexe ligand-récepteur, ce qui permet l’identification des compartiments intracellulaires impliqué,s dans l’internalisation.

B.2.4 - En hybridation in situ fluorescente :
Des sondes oligonucléotidiques ayant incorporé des nucléotides fluorescents sont utilisées.