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III - Utilisation des ligands peptidiques radiomarqués :



1 - Expériences de liaison sur membranes plasmiques, et homogénats de tissus :


L’ultrafiltration : une technique de choix pour séparer L* de RL*.
Cette technique est utilisée lorsque l'on réalise des expériences de liaison sur des homogénats de tissus, et des préparations de membranes plasmiques.

Conditions expérimentales :
La température de travail est de 25° C (température ambiante). Un tampon d'incubation très souvent utilisé est composé de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 ; BSA 0,1-1 %, et contient des inhibiteurs de protéases (voir plus bas).


Protocole opératoire :
Lorsque l'on a incubé le ligand radioactif (L*) avec son récepteur (R), généralement dans un volume de 250 ml, la séparation du complexe RL* est réalisée en filtrant le milieu d'incubation, immédiatement après lui avoir rajouté 2-3 ml de tampon d'incubation. Le complexe RL* est retenu sur le filtre (qui peut être composé d'acétate, nitrate de cellulose, fibre de verre...), alors que le ligand radioactif libre passe au travers du filtre (voir figure ci-dessous).



Attention : Le filtre ne doit pas adsorber L* (ce qui nécessite parfois de tester plusieurs types de filtre).

Lorsque l'on filtre, l’équilibre n’est pas perturbé car RL* est plaqué contre le filtre par le vide. De plus, la vitesse de filtration est bien plus rapide que la vitesse de dissociation.

La plupart du temps, tout de suite après avoir filtré le milieu d'incubation, plusieurs rinçages sont effectués, avec un volume de tampon de 2-3 ml.


Détermination du nombre de rinçages à effectuer :
Afin de déterminer le nombre optimal de rinçages à effectuer lors d'une expérience de liaison, on étudie la liaison spécifique en fonction du nombre de rinçages effectués rapidement et avec un même volume de tampon (2-3 ml) (voir figure ci-dessous).



Détermination de la liaison spécifique :
La terminologie des conditions étudiées dans une expérience de liaison est la suivante :

- Condition A :
elle consiste à déterminer de la liaison totale (R + L* ).

- Condition B :
elle consiste à déterminer de la liaison non spécifique (R + L* + L froid en excès ).

- Condition C :
elle consiste à filtrer le ligand radioactif L* seul.

- Condition D :
elle consiste à filtrer le ligand radioactif L* plus du ligand froid en excès.

Si l’adsorption du L* au filtre est nulle ou peu importante, la liaison spécifique sera égale à :

Liaison spécifique = A - B

Si l’adsorption du L* au filtre reste importante après avoir essayé tous les types de filtres, la liaison spécifique devra être calculée de la manière suivante :

Liaison spécifique = A - B - (C - D)


Les enzymes protéolytiques et leurs inhibiteurs :
Lorsque l'on effectue un homogénat ou une préparation de membranes, à partir de cellules en culture, de tissu, ou d'un organe, de nombreuses activités enzymatiques sont libérées dans le milieu. Les enzymes à activité protéolytiques sont génantes car elles vont entraîner une dégradation du récepteur et du ligand, si ce dernier est un peptide ou une protéine. Les expériences de liaison sur homogénats ou sur membranes plasmiques seront donc réalisés en présence d'inhibiteurs de protéases. Le tableau ci-dessous cite quelques inhibiteurs pour chacune des quatre classes d'enzymes protéolytiques.

Famille : Exemple : Inhibiteur :
Protéases à sérine trypsine
chymotrypsine
acétylcholinestérase
subtilisine
- DFP : di isopropyl fluorophosphate
- PMSF : phényl méthyl sulfonyl fluorure
- leupeptine
- aprotinine
Protéases à cystéine
(à thiol)
papaïne - iodo acétamide
- cystatine
- leupeptine
Métalloprotéases carboxypeptidase A - EDTA
- EGTA
- bestatine (aminopeptidases)
- O-phénantroline
Protéases acides
(à acide aspartique,
aspartyl protéases)
pepsine, cathepsine D - pepstatine



2 - Expériences de liaison sur des cellules en culture :

Conditions expérimentales :
Le plus souvent, ce type d'expérience est réalisé en boîte de culture de 24 puits.

Conditions indispensables :
  • Le L* ne doit pas adhérer au plastique de la boîte.
  • Même nombre de cellules par puits (105-106 cellules).
  • Les cellules doivent adhérer fortement au plastique pour résister aux rinçages (sinon un prétraitement du plastique par de la polylysine (ou autre) est nécessaire).
  • Si les cellules ne sont toujours pas adhérentes :
  • liaison sur cellules en suspension.
  • séparation de L* et RL* par ultrafiltration.


Composition du tampon physiologique utilisé :

NaCl(140 mM)
KCl (3-5 mM)
Mg++ (sous la forme de MgCl2 )(0,8 mM)
Ca++ (sous la forme de CaCl2 )(1,8 mM)
Tampon phosphate pH 7,4(20-25 mM)
BSA(0,1-1 %)


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