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Les papillomavirus et la régulation de la transcription

Auteur : Dr. Isabelle BOUALLAGA

Institut Pasteur - Unité "Expression génétique et Maladies", Département de Biologie du Développement, Paris - France.


Chapitre I. Introduction aux papillomavirus :

I. Caractéristiques des Papillomavirus.

II. E6 et E7, protéines transformantes.

III. E1 et E2, protéines régulatrices :

III.1. E1 est essentielle à la réplication virale :

E1 est une protéine nucléaire de 600 à 650 acides aminés, et de poids moléculaire variant entre 68 et 85 kDa, ayant une activité hélicase dépendante de l’ATP. Elle est essentielle à la réplication du génome viral, qu’elle fixe sur un site spécifique situé entre deux sites de fixation de E2, pour HPV18 (Demeret et al., 1995 ; Desaintes and Demeret, 1996). Cette séquence est entourée par deux régions riches en A/T facilitant l’ouverture des deux brins par l’hélicase. L’origine de réplication des papillomavirus coïncide avec les séquences régulatrices de la transcription du promoteur précoce, ce qui suggère une intrication étroite du contrôle transcriptionnel et réplicatif.

La structure du cristal du domaine de fixation à l’ADN de E1 a permis de préciser l’interaction E1/ ADN et de modéliser la formation du complexe initiateur (Enemark et al., 2000). L’affinité de E1 pour son site étant faible, la fixation de E1 sur l’origine de réplication dépend de son interaction avec la protéine E2 (Desaintes and Demeret, 1996 ; Ustav and Stenlund, 1991). La fixation coopérative des deux protéines permet la formation d’un complexe hexamérique de E1, capable, après le départ de E2, de déformer l’ADN pour l’initiation de la réplication (Sedman and Stenlund, 1998) (Figure 2). La formation de l’hexamère pourrait aussi être facilitée par l’intervention des deux protéines chaperonnes, HSP70 et HSP40 (Liu et al., 1998). E1 se déplace ensuite le long de la molécule dans le sens 3’-5’ sur le brin matrice (Seo et al., 1993).



Figure 2 : E1, E2 et la réplication. L’initiation de la réplication nécessite aussi la présence (i) de la protéine RPA, qui se fixe sur l’ADN simple brin et le stabilise, (ii) des topoisomérases I et II, qui suppriment la superhélicité induite par le déroulement de la double hélice, (iii) de l’ADN polymérase a, qui interagit directement avec E1, (iv) de l’ADN polymérase d, et (v) de ses cofacteurs PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) et RFC (Replication Factor C) (Desaintes and Demeret, 1996; Melendy et al., 1995 ).



Les déformations de l’ADN induites par E1 au niveau de l’origine de réplication virale, pourraient être facilitées par un remodelage chromatinien préalable. En effet, des expériences d’interaction en double-hybride chez la levure ont révélé une interaction directe avec hSNF5, une protéine du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF (Lee et al., 1999). Le facteur hSNF5 exercerait un rôle sur la réplication via E1. De même, une interaction de E1 avec l’histone H1 a été observée, conduisant à une dissociation de l’histone sur son site (Swindle and Engler, 1998). En plus de son rôle d’hélicase, E1 pourrait ainsi avoir un rôle sur la structure chromatinienne entourant l’origine de réplication (Figure 2).

La protéine E1 est régulée post-traductionellement. Elle subit tout d’abord des phosphorylations (sur la sérine 48 par exemple pour BPV-1 E1), par des complexes cycline/ CDK, par la CKII (Casein Kinase II) ou par les kinases PKA et PKC de la voie des MAPK. Ces phosphorylations modulent ainsi son activité réplicative (Bryan et al., 2000; Cueille et al., 1998 ; McShan and Wilson, 1997; McShan and Wilson, 2000; Zanardi et al., 1997). Elle est aussi sumoylée par Ubc9 (addition du peptide SUMO, de la famille de l’ubiquitine), modification nécessaire à son accumulation nucléaire et à la réplication du virus (Rangasamy and Wilson, 2000). Ces modifications seraient essentielles à la régulation de l’initiation de la réplication du génome viral, pour qu’il n’y ait qu’une réplication par phase S (phase épisomale de la persistence virale).


III.2. E2, protéine multifonctionnelle :

La protéine E2 des papillomavirus détient un rôle fondamental dans le cycle viral : elle régule la transcription des oncogènes viraux, active la réplication du génome viral en association avec la protéine E1, et présente une action antiproliférative sur les cellules qui l’expriment.


a. Structure et régulation post-traductionnelles de la protéine :

La protéine E2 est une protéine nucléaire d’environ 45 kDa extrêmement structurée, étant organisée en trois domaines fonctionnellement distincts (Figure 3) (Giri and Yaniv, 1988). Le premier domaine, dit transactivateur, s’étend sur environ 200 acides aminés dans la partie Amino-terminale de la protéine, et est relativement bien conservé (30 % d’identité).



Figure 3 : Modèle structural de E2. D’après (Hegde et al., 1992) et (Antson et al., 2000).




Le cristal de ce domaine a été récemment établi, et montre deux sous-domaines : le premier (nucléotides 1 à 92) est constitué par trois hélices a antiparallèles, et le deuxième (nucléotides 110 à 201) par des feuillets b antiparallèles, les deux sous-domaines étant reliés par un pivot formé par deux tours (Antson et al., 2000). Ce domaine est responsable de la plupart des activités de E2, qu’il s’agisse de l’activation de la transcription, ou de son rôle dans l’initiation de la réplication. Il est aussi la cible d’une ubiquitine-ligase qui induit la dégradation de la protéine E2 par le protéasome (Bellanger et al., 2001). Cette dégradation, comme celle de E1, pourrait être dépendante du cycle cellulaire, et donc réguler à la fois la réplication et la transcription virale.

La région charnière correspond au domaine central de la protéine E2. Elle est peu conservée parmi les papillomavirus, ni dans sa séquence, ni dans sa taille, et est peu structurée. Elle contient des sites de phosphorylation, et notamment une séquence PEST chez BPV, responsable de l’ubiquitination et de la dégradation de la protéine, qui n’est cependant pas conservée chez HPV18 (Penrose and McBride, 2000). Un signal de localisation nucléaire pourrait être présent dans la région charnière de E2 de HPV11 (Zou et al., 2000).

La troisième région contient le domaine de dimérisation et de fixation à l’ADN. Elle s’étend sur une centaine d’acides aminés en C-terminal de la protéine, et sa séquence, comme sa structure sont très conservées. La structure cristalline d’un dimère de E2 complexé à l’ADN révèle un tonneau b formé par 8 feuillets b antiparallèles et 4 hélices a à l’extérieur qui contactent le grand sillon de l’ADN (Hegde et al., 1992). La fixation à l’ADN est spécifique sur un site consensus palindromique de 12 pb, ACCgNNNNcGGT, chaque monomère se fixant sur un hémisite (Dostatni et al., 1988). N peut représenter n’importe quelle base nucléotidique, mais il existe selon les souches virales des différences d’affinité des protéines E2 pour les différents sites (Kim et al., 2000). Par exemple, les E2 de virus infectant les muqueuses, tels que HPV16, 18 et 11, ont une affinité plus forte pour les sites riches en A/T. L’interaction de E2 sur son site induisant un changement conformationnel de l’ADN, le changement d’affinité serait dû à une plus grande flexibilité de ces séquences.


b. E2 est un régulateur du promoteur précoce :

La protéine E2 est tout d’abord un facteur de transcription (Figure 3). Ses propriétés transactivatrices ont été démontrées chez BPV1, qui contient de nombreux sites de fixation pour le facteur viral (Spalholz et al., 1985). E2 peut également activer la transcription à partir de promoteurs hétérologues devant lesquels sont placés des sites E2 (Hawley-Nelson et al., 1988 ; Lambert et al., 1989 ; Thierry et al., 1990). La fixation de E2 à un site unique ne permet qu’une faible activation transcriptionnelle, environ 2 fois, alors que deux sites fonctionnent de manière synergique formant une région amplificatrice autonome capable d’activer de 50 à 100 fois la transcription (Thierry et al., 1990). Les mécanismes moléculaires de la transactivation par E2, et notamment de la synergie, ne sont pas clairs. D’une part, E2 pourrait recruter le PIC en interagissant avec TBP (Rank and Lambert, 1995). D’autre part, un remodelage de la chromatine est observé lors de l’activation par E2, mais le rôle de E2 dans ce remodelage n’est pas connu (Lefebvre et al., 1997). Le coactivateur CBP/ p300 serait impliqué dans la transactivation par E2, la protéine E1A connue pour séquestrer CBP/ p300, ayant un effet inhibiteur sur l’activité de BPV E2 (Peng et al., 2000). Cependant, il n’existe qu’une faible interaction directe entre E2 et p300. Une protéine transactivatrice de 37kDa, AMF-1/ Gps2, précédemment isolée comme partenaire de E2 par des expériences d’interaction en double-hybride chez la levure (Breiding et al., 1997), interagit avec p300, et forme avec BPV E2 un complexe ternaire stable, ayant une activité HAT (Peng et al., 2000). L’activation transcriptionnelle par E2 pourrait donc impliquer un remodelage chromatinien indépendant de la réplication.

Les séquences régulatrices de la transcription coïncidant avec l’origine de réplication, l’effet de E1 sur l’activation par E2 a été recherché. L’activation transcriptionnelle médiée par E2 est en effet augmentée en présence de E1 (Demeret et al., 1998). Cet effet est indépendant de la fixation de E1 sur son site, E1 étant recrutée par des interactions protéiques avec E2 (Figure 2). Son activité hélicase pourrait être impliquée, de même qu’un possible recrutement des facteurs de remodelage de la chromatine, E1 interagissant avec hSNF5, et pouvant même, à lui seul, activer la transcription de gènes eucaryotes (Lee et al., 1999 ; Monini et al., 1993).

L’action de la protéine E2 dans le contrôle transcriptionnel des papillomavirus génitaux humain est avant tout une répression de l’expression des protéines précoces (Figure 4) (Bernard et al., 1989; Thierry and Yaniv, 1987a). La transcription des fonctions transformantes E6 et E7 de HPV18 dépend du promoteur précoce P105, qui est en aval d’une région non codante d’environ 1000 pb (Thierry et al., 1987b). Cette région contient en position centrale une région amplificatrice de 230 pb spécifique de tissu, et de nombreux sites de fixation pour des facteurs de transcription cellulaires. Elle contient aussi 4 sites de fixation pour E2 conservés parmis les HPVs génitaux, 3 très proches du promoteur, le quatrième étant isolé en amont de l’amplificateur (Garcia-Carranca et al., 1988).

L’analyse mutationnelle des sites de fixation pour E2 a montré que les deux sites proximaux étaient nécessaires à la répression chez HPV16 et 18 (Romanczuk et al., 1990; Thierry and Howley, 1991 ). Des études plus précises ont alors montré que la fixation de E2 sur le site proximal empêchait stériquement la formation du PIC et notamment la fixation de TFIID (Dostatni et al., 1991). De plus, le deuxième site de fixation pour E2 chevauche un site SP1 qui s’est révélé essentiel à l’initiation de la transcription à P105 (Gloss and Bernard, 1990). La fixation de E2 et SP1 à leur site respectif étant exclusive, le deuxième site participe aussi à la répression (Demeret et al., 1997; Demeret et al., 1994 ). Récemment, des études in vitro effectuées avec HPV11 E2, ont montré que seul un complexe d’initiation minimal constitué par TBP, TFIIB, l’ARNpolII et TFIIF était assez stable pour lever la répression médiée par E2 sur les deux sites proximaux (Hou et al., 2000).




Figure 4 : E1, E2 et la transcription.




c. E2 est essentielle à la réplication virale :

L’implication de la protéine E2 dans la réplication du génome viral est aujourd’hui établie pour les virus BPV et HPV (Figure 2) (Desaintes and Demeret, 1996; Ustav and Stenlund, 1991 ). La fixation de E2 sur les sites proches de l’origine est indispensable à son action (Demeret et al., 1995; Ustav et al., 1993 ). Pour BPV1, l’interaction directe entre E1 et E2 est essentielle, les deux facteurs se fixant coopérativement sur l’ADN (Le Moal et al., 1994; Lusky et al., 1993 ). La protéine E2 agit en favorisant la fixation de E1 sur son site, à l’origine de réplication (Sedman and Stenlund, 1995).

L’observation récente de l’interaction de E2 avec le coactivateur CBP via AMF-1 et l’intrication forte des régulations transcriptionnelle et réplicative ouvre une voie non explorée, celle du mécanisme d’ouverture de la chromatine : le recrutement de complexes de remodelage par E1 et E2 pourrait, en effet, être synergique.


d. Rôle antiprolifératif de E2 :

La protéine E2 est, comme nous venons de le voir, essentielle à la transcription et à la réplication virale. Pourtant, dans les cellules transformées par HPV18, la région codant pour la protéine E2 est systématiquement interrompue par l’intégration du virus dans le génome cellulaire (Berumen et al., 1994; Schwarz et al., 1985 ). De même, l’interruption du gène E2 chez HPV16 représente un mauvais pronostique quant aux lésions cancéreuses (Kalantari et al., 1998; Romanczuk and Howley, 1992 ). E2 étant un répresseur de l’expression des oncogènes E6 et E7 chez ces virus, la délétion du gène favorise la tumorigénèse, par une dérégulation de l’expression des oncogènes. Pour savoir dans quelle mesure l’absence de E2 mène à la transformation, la protéine a été réintroduite dans des cellules issues de carcinome cervical humain transformées par HPV18, telles que les cellules HeLa. Dans ces cellules, l’expression de E6 induit la dégradation de p53 (Voir paragraphe sur E6). La réintroduction de E2 inhibe la transcription de E6 et augmente la quantité de protéine p53 (Desaintes et al., 1997; Hwang et al., 1996 ). Cette protéine, transcriptionellement active, induit un arrêt du cycle cellulaire en phase G1, par l’activation du complexe p21/WAF qui réprime l’action du complexe cycline E/ CDK2. Cet arrêt en G1 pourrait ensuite conduire les cellules à la sénescence, dans les cellules transformées par HPV (Wells et al., 2000).

La réintroduction de la protéine HPV18 E2 dans les cellules HeLa conduit aussi à l’apoptose de ces cellules (Desaintes et al., 1997). Contrairement à l’arrêt en G1, cet effet est indépendant de l’activation de p53, un mutant de E2 incapable d’activer p53 gardant son pouvoir apoptotique (Desaintes et al., 1999). De plus, des expériences de vidéo-microscopie en temps réel, associées à un dosage de p53, ont pu montrer que la mort par apoptose des cellules HeLa précédait l’activation transcriptionnelle de p53. Enfin, des données récentes montrent que l’apoptose induite par E2 n’est dépendante, ni de la présence de séquences virales, ni de la présence de p53 : les cellules Saos, cellules issues d’un ostéosarcome ne contenant ni le gène p53 (muté par délétion), ni de séquences papillomavirales, meurent spécifiquement par apoptose lorsqu’elles sont infectées par un adénovirus exprimant la protéine E2 (Demeret and Thierry, personnal communication).

La réintroduction de HPV16 E2 dans les cellules HeLa conduit elle aussi à l’arrêt en G1 et à l’apoptose (Webster et al., 2000). Par contre, l’utilisation d’une protéine dominant-négatif de p53 inhibe l’apoptose induite par E2. De même, les auteurs trouvent une inhibition de l’apoptose en présence de E6. Ils en concluent que l’apoptose médiée par HPV16 E2 dépend de l’inhibition de l’expression de E6 et donc de l’activation transcriptionnelle de p53. Les propriétés antiprolifératives de E2 pourraient donc différer selon les souches virales. Récemment, des études ont montré que les oestrogènes et la progestérone auraient un effet activateur de l’apoptose médiée par E2 de HPV16 (Webster et al., 2001). Les mécanismes de cette activation restent à élucider.


IV. L’amplificateur transcriptionnel d’HPV18.


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