Chapitre II. Naissance d’un ARN messager.


I. Les éléments essentiels à la transcription basale :

I.1. ADN et chromatine.

I.2. Le complexe de pré-initiation de la transcription (PIC) :

La formation du complexe de pré-initiation est parfaitement ordonnée, à la fois par la présence de séquences de reconnaissance sur l’ADN, et par la mise en place d’interactions protéiques affines et spécifiques.


a. Des séquences conservées balisent les régions promotrices :

Les promoteurs correspondent aux séquences situées autour du site d’initiation de la transcription de l’ARNm (+1), sur une région relativement courte de l’ADN (plus ou moins 100 pb). Ils contiennent plusieurs "boîtes" permettant le recrutement de l’ARN polymérase II (Figure 7). Historiquement, une première région riche en AT, boîte TATA, s’est révélée essentielle pour le positionnement de l’ARNpolII, sa mutation entraînant une initiation hétérogène (Mathis and Chambon, 1981). Cette séquence fixe un facteur appelé TBP (TATA Binding Protein), qui appartient au complexe TFIID (décrit plus loin).




Figure 7 : Boîtes constituant le core du promoteur.


L’existence de promoteurs dépourvus de boîte TATA (50 % des promoteurs chez la drosophile (Burke et al., 1998)) a conduit à la mise en évidence d’une deuxième séquence relativement conservée, appelée Inr car comprenant le site d’initiation de la transcription (Figure 7) (Smale and Baltimore, 1989 ; Smale et al., 1998). Cette séquence est du type YCANTYY (Y = C ou T, N = A, C, G, T) (Bucher, 1990 ; Javahery et al., 1994), et semble pouvoir recruter TFIID via deux TAFs (Transcription Associated Factor), les TAFs 250 et 150 (Chalkley and Verrijzer, 1999). L’affinité de TBP pour ce site est relativement faible et n’est observée dans des expériences d’empreintes à la DNase I, qu’en présence d’un complexe activateur de la transcription. Un promoteur sans boîte TATA peut donc avoir une activité basale plus faible, mais associées, les deux boîtes coopèrent au recrutement de l’ARNpolII et augmentent l’activité du promoteur (Garraway et al., 1996).

Une troisième boîte appelée DPE (Downstream Promoter Element) a été identifiée chez la drosophile, sur des promoteurs dénués de boîte TATA, en aval du site d’initiation de la transcription, symétriquement à la boîte TATA (+28 à +34 ; Figure 7) (Burke and Kadonaga, 1996). Cette séquence est conservée de la drosophile à l’humain, puisque par exemple retrouvée sur le promoteur du gène IRF-1 humain (Interferon Regulatory Factor-1) (Burke and Kadonaga, 1997). En présence de la boîte TATA, cette séquence n’a pas d’effet sur la fixation de TFIID sur le promoteur. Par contre, la DPE compense totalement la perte d’activité due à une mutation de la boîte TATA (Burke and Kadonaga, 1996). Elle permettrait le recrutement de TBP via TAFII28 et TAFII80. Sa position symétrique de la boîte TATA par rapport au site d’initiation de la transcription ainsi que son rôle, en font un analogue structural et fonctionnel de la boîte TATA (Burke et al., 1998).

Les trois boîtes ne sont pas retrouvées sur tous les promoteurs. Cependant, les promoteurs naturels ont souvent soit une boîte TATA et une boîte Inr, soit une boîte DPE et une boîte Inr, les boîtes TATA et DPE faisant double emploi. L’Inr semble augmenter significativement la durée de vie du complexe TFIID/ADN, elle permet en général une plus forte activité basale de la transcription (Smale et al., 1998).

Récemment une quatrième région riche en GC, localisée juste avant la boîte TATA, a été décrite comme fixant le facteur TFIIB (Figure 7) (Lagrange et al., 1998 ; Reinberg et al., 1998). BRE (TFIIB Recognition Element) est essentielle à l’initiation de la transcription, et définit notamment la direction de la transcription (Littlefield et al., 1999; Tsai and Sigler, 2000 ).


b. Les facteurs de transcription de la famille TFII :

L’ARN polymérase II (ARNpolII) est un complexe multiprotéique (12 sous-unités) isolé biochimiquement grâce à sa capacité à synthétiser de l’ARN à partir d’ADN de thymus de veau in vitro (Figure 9). Le développement de systèmes de transcription in vitro a permis la mise en évidence des facteurs généraux de transcription de la famille TFII (de A à H, tableau). Ils sont indispensables aussi bien pour la transcription basale, qu’activée. Certains de ces cofacteurs permettent le recrutement de l’ARNpolII sur le promoteur, via une fixation spécifique à l’ADN, (TFIID et TFIIB, voir Figure 7 et Figure 8), d’autres font le lien entre l’ARNpolII ou le complexe de pré-initiation, et les facteurs de transcription activateurs (TFIIA et TFIID via les TAFs, voir plus loin), d’autres enfin favorisent l’élongation (TFIIE, F et H). Chaque facteur de transcription général est lui-même un assemblage multiprotéique variable, chaque sous-domaine ayant sa propre spécificité (Figure 9). L’ordre de fixation du complexe de pré-initiation (PIC) contenant la polymérase et les facteurs généraux de la transcription est aujourd’hui bien documentée (Figure 8) (Hoffmann et al., 1997 ; Lee and Young, 2000; Patikoglou and Burley, 1997 ).



Figure 8 : Assemblage du complexe de préinitiation.


L’assemblage du PIC débute par la fixation du complexe TFIID sur la boîte TATA, via le facteur TBP (TATA Binding Protein) et sa stabilisation par TFIIA (Figure 8). Le facteur TFIIA n’est pas essentiel à la transcription basale, mais participe à l’activation transcriptionnelle. Ce facteur agit comme un anti-répresseur en se positionnant sur l’ADN de façon adjacente à TBP, et en déplaçant, de ce fait, les facteurs tels que NC2 (Dr1/DRAP1), TAFII250 et Mot1 qui entravaient la fixation de TBP (Pugh, 2000). La fixation sur l’ADN du complexe TFIID forme une surface capable de recruter TFIIB sur le site BRE. Le positionnement de TFIID sur la boîte TATA donnant lieu à une protection symétrique de l’ADN le recrutement de TFIIB en amont de TFIID oriente le PIC, et donc l’initiation de la transcription. Suit un recrutement coordonné de la forme non phosphorylée de l’ARNpolII, de TFIIF qui positionne l’ARNpolII, de TFIIE qui ouvre la double hélice d’ADN et de TFIIH qui phosphoryle le domaine C-terminal de l’ARNpolII (CTD). Cette phosphorylation libère la polymérase du PIC, et permet le démarrage de la transcription. La terminaison de la transcription est suivie d’un recyclage de l’ARNpolII en sa forme non phosphorylée permettant à l’enzyme de ré-initier une transcription. La liaison de TBP à la boîte TATA serait une étape lente produisant un complexe ADN/protéine ayant une longue durée de vie. La ré-initiation serait donc possible tant que TFIID n’est pas dissocié du promoteur.





Figure 9 : Tableau des différents facteurs de transcription associé au complexe de préinitiation.
D’après (Gangloff et al., 2001; Lee and Young, 2000 ).



TFIID a été originellement isolé grâce à sa capacité à reconstituer une activité transcriptionnelle basale de l’ARNpolII in vitro. Son haut poids moléculaire a immédiatement suggéré qu’il s’agissait d’un complexe multiprotéique. En fait, de plus en plus de facteurs sont aujourd’hui associés à TBP, donnant à TFIID un rôle à la fois structural et fonctionnel (Figure 9 et Figure 10).


c. Le facteur TFIID a un rôle fondamental dans l’initiation de la transcription :

Le facteur central de TFIID est la protéine se liant à la boîte TATA, ou TBP (TATA Binding Protein). TBP fait penser à une "selle de cheval" moléculaire symétrique avec ses 4 hélices a sur le dessus de la protéine, et ses 10 feuillets b en dessous, contactant l’ADN. La cristallisation du domaine C-terminal de TBP fixé à l’ADN, a montré que cette interaction était extrêmement structurée. En effet, la reconnaissance de la boîte TATA s’effectue via le petit sillon induisant une forte courbure de l’ADN. De plus, l’intercalation de 2 résidus phénylalanine entre les 2 premiers et les 2 derniers nucléotides de la boîte TATA s’accompagne d’un déroulement partiel de la double hélice le long des 8 nucléotides de la boîte, relaxation essentielle à l’initiation de la transcription.

TBP est entourée de sous-unités protéiques appelées TAFs (TBP Associated Factor, voir Figure 9). Comme nous allons le voir, deux grandes familles de TAFs semblent rassemblées au sein d’un même complexe. La plupart de ces TAFs sont essentielles pour la viabilité de la cellule (inactivation chez la levure (Green, 2000)). In vitro, elles ne sont pas nécessaires pour la transcription de base, sauf pour les promoteurs dépourvus de boîte TATA (Martinez et al., 1994), mais sont essentielles pour la transcription régulée ; elles sont donc considérées comme des coactivateurs faisant le lien entre les facteurs fixés en amont du promoteur et le PIC (Verrijzer and Tjian, 1996). Les arguments en faveur de ce modèle sont nombreux (Green, 2000) : (1) certaines des TAFs (ou des homologues) ont été retrouvées dans d’autres complexes multiprotéiques coactivateurs tels que STAGA (homologue humain du complexe SAGA de la levure, SPT3-TAFII31-GCN5-L acétyltransférase), P/CAF (p300/CREB-binding protein-associated factor) et TFTC (TBP-free TAFII-containing complex) (Brand et al., 1999 ; Martinez et al., 1998 ; Ogryzko et al., 1998). Ces complexes peuvent même avoir une certaine redondance fonctionnelle (Lee et al., 2000b) ; (2) TAFII250 contient des activités de modification de la chromatine (acétylase, kinase et même ubiquitine-ligase) ; (3) certains facteurs interagissent directement avec des activateurs ou des coactivateurs ; (4) les différentes purifications de TFIID ont montré des différences quantitatives et qualitatives dans l’association des TAFs avec TBP. Notamment, la stœchiométrie n’est pas toujours respectée. La formation du complexe TFIID pourrait être spécifique de l’activation d’un promoteur donné, par un signal donné, certaines TAFs étant recrutées par des activateurs spécifiques, comme TAFII130, médiatrice de SP1, et TAFII105, spécifique des lymphocytes B (Furukawa and Tanese, 2000).



Figure 10 : Deux modèles faisant intervenir TFIID dans la formation du PIC.
A. Les gènes inactifs sont hautement compactés par les nucléosomes, et les promoteurs inaccessibles à la machinerie transcriptionnelle. L’activation de la transcription induit un remodelage de la chromatine qui permet la fixation de TFIID sur le promoteur, le recrutement subséquent du PIC, et l’initiation de la transcription.
B. La transcription de certains gènes pourraient n’être que “ suspendue ”, le facteur TFIID inactif présent sur le promoteur faisant office de nucléosome. L’activation de la transcription induit un remodelage de TFIID, le recrutement subséquent du PIC, et l’initiation de la transcription. D’après (Hoffmann et al., 1997).


D’autre part, l’analyse de ces facteurs (séquence, biochimie, structure) a révélé l’homologie de certaines TAFs avec les histones : H4 pour TAFII80 et TAFII18, H3 pour TAFII31 et TAFII28, H2B pour TAFII20 (Gangloff et al., 2001; Michel et al., 1998 ). Ces protéines s’associent en octamère pour former une structure ressemblant à un nucléosome, induisant un changement conformationnel de l’ADN, qui rappelle la super-hélice formée autour du nucléosome. De plus, le complexe subirait des modifications post-traductionnelles (phosphorylations) inhibant l’activation des gènes lors de la mitose (Hoffmann et al., 1997). Le rôle de TFIID est de recruter le complexe de pré-initiation, et notamment l’ARNpolII, sur le site d’initiation de la transcription. Il serait lui-même recruté par un remodelage de la chromatine localisée sur le promoteur et un co-recrutement par TFIIA. Cependant, des expériences d’empreintes in vivo suggèrent la présence du complexe sur des promoteurs inactifs, comme le promoteur de l’interleukine 2 dans des lymphocytes T inactifs (Brunvand et al., 1993). Il pourrait donc remplacer, sur certains promoteurs, notamment des promoteurs "activables", la structure nucléosomale, et être remodelé, comme les nucléosomes, par des modifications post-traductionnelles engendrées par l’activation de la transcription (Figure 10).


II. Les éléments régulateurs.

III. L’architecture nucléaire organise la transcription.