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Les papillomavirus et la régulation de la transcription

Auteur : Dr. Isabelle BOUALLAGA

Institut Pasteur - Unité "Expression génétique et Maladies", Département de Biologie du Développement, Paris - France.


Chapitre II. Naissance d’un ARN messager.


I. Les éléments essentiels à la transcription basale.

II. Les éléments régulateurs.

III. L’architecture nucléaire organise la transcription :

Le séquençage du génome humain va apporter beaucoup à l’étude transcriptionnelle des gènes permettant, entre autres, la mise en évidence des régions de régulation transcriptionnelle. Cependant, l’analyse séquentielle de l’ADN ne peut pas tout expliquer. Notamment, lors du développement d’un organisme ou de la différenciation d’une cellule, de grandes régions géniques sont mises sous silence du point de vue transcriptionnel grâce à des mécanismes complexes impliquant l’architecture globale du noyau.


III.1. Les territoires chromosomiques :

L’ADN interphasique a longtemps été considéré comme une pelote de fils disposés aléatoirement dans le noyau. Le développement de techniques de fluorescence in situ (FISH) appliquées à la détection des acides nucléiques a révélé qu’au contraire, les chromosomes se disposaient selon des territoires tridimensionnels distincts, ou "territoires chromosomiques" (TC), le reste du noyau étant par opposition appelé domaine "interchromatique" (IC) (Cremer and Cremer, 2001).

La disposition des chromosomes les uns par rapport aux autres dans le noyau est encore controversée. Il semble toutefois qu’il y ait quelques données plus ou moins conservées : tout d’abord, les petits chromosomes seraient situés au centre du noyau, et les grands chromosomes en périphérie (Sun et al., 2000). Ensuite, deux chromosomes de taille similaire auraient une position différente en fonction de leur contenance en gènes : par exemple les chromosomes 18 et 19 ont une taille proche (respectivement de 85 et 67 Mb). Le chromosome 18, pauvre en gènes, est retrouvé à la périphérie du noyau, alors que le chromosome 19, riche en gènes, a une position plus centrale (Croft et al., 1999).

Au sein d’un territoire chromosomique, la position d’un gène est déterminante pour son activité. Les bras longs et courts du chromosome occupent des territoires distincts, de même que la région centromérique. Il a été montré que la position d’un gène par rapport au centromère variait avec son activité transcriptionnelle : un gène actif est significativement plus éloigné du centromère qu’un gène inactif, et le repositionnement artéfactuel d’un gène actif près du centromère conduit à son inactivation (Brown et al., 1999 ; Brown et al., 1997). De même, les régions pauvres en gènes, ou les régions denses en chromatine contenant des gènes inactifs, se situent principalement à la périphérie du nucléole et du noyau, au contact de la lamina, alors que les régions moins denses, transcrites, se déploient jusqu’aux régions inter-chromatiques, entre deux territoires (Cremer and Cremer, 2001). Enfin, les territoires chromosomiques sont subdivisés en domaines, plus ou moins gros, de 100kb à 1Mb. Les gènes transcrits sont retrouvés à la surface des fibres condensées, la zone inter-chromatique étant le lieu de la transcription, de l’épissage et la maturation des ARN. Certaines fibres hautement actives constituent même des boucles dans l’espace inter-chromatique, comme cela a été montré pour le gène du CMH sur le chromosome 6 (Volpi et al., 2000).

Entre les territoires chromosomiques circulent de nombreuses protéines régulatrices qui ont une affinité, à la fois pour l’ADN et pour d’autres protéines. Cette affinité est à l’origine de la formation d’amas protéiques visibles en microscopie électronique, produits par l’agrégation des facteurs, et déterminants dans la régulation de la transcription.Organisation spatiale de l’expression des gènes

Comme nous l’avons vu, l’expression des gènes nécessite l’intervention successive de nombreuses protéines, ou complexes protéiques. On peut se demander comment s’effectuent les mouvements au sein du noyau, et notamment, suite à un stimuli, comment une protéine va pouvoir trouver sa cible et déclencher la transcription en une courte période de temps. La compartimentation du noyau pourrait expliquer en partie la spécificité et la rapidité de ces processus (Misteli, 2001).


a. Les différents compartiments nucléaires :

Autour des territoires chromosomiques, dans l’espace interchromatique, d’autres structures sont visibles au microscope électronique. Le compartiment le plus visible est constitué par les nucléoles, usines de fabrication des sous-unités ribosomales. Cette structure représentant un modèle d’organisation spatiale de l’expression des gènes, son étude sera développée dans le paragraphe suivant. D’autres "corps", dont l’absence peut-être liée à l’apparition de maladies, semblent impliqués dans la transcription et/ou l’épissage des ARN (Misteli, 2000).

Les PODs (PML nuclear bodies ou ND10 ou Kr bodies) sont définis par leur contenu en protéine PML (ProMyelocytic Leukemia protein), initialement identifiée comme la protéine fusionnée au récepteur a de l’acide rétinoïque dans la leucémie du même nom (Seeler and Dejean, 1999). Ils ont un diamètre d’environ 1µm et il y en a de 10 à 20 par noyau. Ils sont transcriptionnellement actifs, semblent notamment associés aux gènes viraux (Maul, 1998 ; Wienzek and Dobbelstein, 2001), et co-localisent avec CBP (Doucas, 2000). Ils pourraient donc avoir un rôle dans la régulation de la transcription, et dans l’infection virale.

Les "speckles" sont des structures ponctuées contenant les petites ribonucléoprotéines (snRNPs) correspondant au complexe d’épissage des ARN messagers (spliceosome). Leur rôle est mal déterminé : ils pourraient correspondre à des centres de stockage, mais pourraient être fonctionnellement impliqués dans la transcription puisqu’ils disparaissent en présence d’inhibiteurs de la transcription. Ils peuvent être divisés en deux entités morphologiques distinctes au microscope électronique : il y a d’une part les IGCs (Interchromatin Granule Clusters) qui correspondent à des amas de granules denses aux électrons d’environ 20 nm de diamètre situés dans l’espace interchromatinien, et d’autre part des fibres périchromatiques isolées, à la périphérie des IGCs.

Les corps de Cajal (coiled body) ont un diamètre d’environ 1µm et sont présents en 1 à 3 exemplaires par noyau. Ils contiennent de nombreuses protéines, dont la coïline-p80 (marqueur de ces structures), de nombreux facteurs de transcription, ainsi que des petites ribonucléoprotéines et des facteurs d’épissage des ARN. Leur rôle est encore mal connu, mais ils pourraient servir de lieu de stockage. Ils sont souvent associés à des histones actives et ont aussi été proposés comme régulateurs de l’expression des gènes des histones (Schul et al., 1999).

Malgré l’absence de structures membranaires internes, le noyau est donc compartimenté. La formation de ces structures nucléaires est cependant dynamique, et auto-organisée autour d’une fonction (transcription des ARNr dans le nucléole, stockage pour les corps de Cajal), la taille des compartiments dépendant du flux de ses composants. Le nucléole, responsable de la formation des sous-unités ribosomiques en est le meilleur exemple.


b. Un exemple : Le nucléole :

Le nucléole est le compartiment nucléaire le mieux caractérisé, aussi bien structurellement que fonctionnellement (Figure 16). Il est la conséquence d’une auto-agrégation des séquences d’ADN codant pour les gènes ribosomaux (28S, 18S et 5,8S), séquences présentes sur plusieurs chromosomes. Son assemblage dépend à la fois de la transcription, et du cycle cellulaire : en effet, lors de la mitose, ou lors d’une inhibition artificielle de l’ARNpolI, les nucléoles (1 à 3 par cellules) disparaissent. Ils ne se reforment qu’en fin de mitose, par regroupements successifs de petites structures.

Le nucléole regroupe plusieurs fonctions : la transcription des ARN ribosomiques (ARNr), leur maturation (clivages nucléiques, modifications chimiques des bases), et l’assemblage des sous-unités ribosomiques à partir des ARNr et des petites ribonucléoprotéines (snRNP). Pour cela, de nombreuses protéines sont présentes qui se regroupent elles-mêmes en sous-domaines concentriques au sein du nucléole (Figure 16) :

Le centre fibrillaire (FC) accumule l’ARNpolI, et pourrait donc constituer un lieu de stockage.

Le composant fibrillaire dense (DFC), autour du centre fibrillaire, correspond à la synthèse des ARNr.

Le composant granulaire (GC correspondrait à l’épissage et la maturation des ARNr (Cook, 1999).

L’accumulation des données de structure et de composition des différents sous-domaines du nucléole, ont permis l’élaboration d’un modèle permettant d’expliquer l’organisation spatiale de la synthèse des sous-unités ribosomiques (Figure 16). Il y a dans une cellule HeLa (triploïde) environ 540 gènes codant pour l’ARNr 45S (unité de transcription), dont environ 120 sont activement transcrits par environ 15000 polymérases (Pombo et al., 2000). Il y a donc au moins 125 ARNpolI actives (CTD phosphorylé) sur chaque unité de transcription. Ces unités de transcription sont elles-mêmes regroupées en 30 centres fibrillaires (4 unités de transcription par centre fibrillaire), elles-mêmes regroupées en 1 à 3 nucléoles (10 centres fibrillaires par nucléole, et plus)... De cette organisation bien précise est née le concept d’usine d’assemblage ("factory") régulant la transcription des gènes (Figure 16). Nous verrons que ce concept pourrait aussi être appliqué à l’ARNpolII.


Figure 16 : Le nucléole, modèle de compartimentation transcriptionnelle.
Photographie au microscope électronique du nucléole, (A) au sein du noyau et (B) détail des différents sous-domaines : centre fibrillaire (FC), composant fibrillaire dense (DFC), composant granulaire (GC). (C) Noyau d’une cellule HeLa dont les transcrits naissant, en vert, ont été synthétisés in vitro en présence de Br-UTP, le reste des acides nucléiques étant en rouge. (D) Modèle d’organisation spatiale de la synthèse des ARNr. D’après (Cook, 1999; Lamond and Earnshaw, 1998 )


c. Compartiments et transcription des ARNm :

L’ARNpolII a longtemps été considérée comme une locomotive sur des rails, se fixant sur l’ADN à transcrire et suivant le gène lors de l’élongation. Cette idée est en fait peu compatible avec les données structurales de l’ARNpolII, (sa taille et composition, son association aux différents complexes multiprotéiques du PIC...), ni même avec la topologie de l’ADN, la structure hélicoïdale induisant un enroulement théorique de l’ARN autour de l’ADN. L’ADN est finalement la plus petite et la plus mobile des structures impliquées, il semble donc plus logique que ce soit l’ADN qui bouge, et non pas la polymérase. L’observation de certains gènes faisant des boucles en dehors du territoire chromosomique lors de l’activation de la transcription renforce cette idée.

La transcription des ARNm pourrait donc, elle aussi, être circonscrite à certaines zones, ou usines d’assemblage. En effet, comme pour l’ARNpolI, environ 65.000 ARNpolII sont actives sur 320.000 molécules au total, mais seulement 8000 foci transcriptionnels sont visibles après marquage. Il y aurait donc des regroupements de 8 ARNpolII par centre, en moyenne (Figure 17) (Pombo et al., 2000). Ainsi, les "speckles" pourraient correspondre à des centres de polymérisation : les fibres périchromatiques contiennent en effet une forme hyperphosphorylée de l’ARNpolII, des facteurs d’épissage de l’ARN et peuvent être marqués avec des ribonucléotides radioactifs. De plus, ces structures se désagrègent en présence d’a-amanitine, inhibiteur de l’ARNpolII (Cook, 1999).

Contrairement aux gènes ribosomiques, un gène transcrit ne semble associé qu’à une polymérase à la fois. Il en découle un modèle fonctionnel cyclique impliquant une fixation préalable de l’ADN sur le site d’assemblage, son passage au travers de la structure lors de la transcription et enfin son détachement (Figure 17) (Cook, 1999 ; Pombo et al., 2000). L’activation d’un gène, dans ce cas dépendrait :

de la distance initiale du gène par rapport à l’usine d’assemblage. Plus un gène serait près du site de polymérisation, plus il pourrait s’attacher facilement. Un gène masqué à l’intérieur d’un territoire chromosomique s’attachera au contraire beaucoup plus rarement.

de la mobilité du promoteur, ce qui est lié à son degré de compaction au sein de la chromatine. Les gènes compactés près de lamina ou du nucléole deviennent pratiquement immobiles et ont donc une probabilité plus faible de rencontrer un site de polymérisation.

de l’affinité du promoteur pour le site de polymérisation. Plus un promoteur sera affin au site, par exemple par la présence de facteurs activateurs interagissant avec le PIC, plus il sera retenu, ou re-capturé, et donc plus il sera transcrit.

Tous ces postulats étant en accord avec les données connues, il est raisonnable de retenir l’hypothèse de ces usines d’assemblage à l’ARNpolII, tout en n’excluant pas la possibilité de transcriptions ponctuellement isolées.



Figure 17 : Usine ARNpolII.
A. Le gène n’est pas transcrit.
B. Les facteurs de transcription augmentent l’affinité de la région promotrice pour l’ARNpolII.
C. Le gène est transcrit, et épissé dans la zone périphérique des centres de polymérisation.
D’après (Pombo et al., 2000; Szentirmay and Sawadogo, 2000).



Pour aller un peu plus loin, il a été suggéré que certains facteurs de transcription, et même certains coactivateurs, pouvaient être concentrés dans des sites de polymérisation particuliers, les gènes activés par ces facteurs n’étant donc transcrits que s’ils sont associés à ce site particulier. Ainsi, les centres PML semblent regrouper l’ARNpolII et CBP (von Mikecz et al., 2000). De même, il existe des domaines OPT (Oct-1/ PTF/ Transcription, (Pombo et al., 1998)) présents au nombre de 1 à 3 par cellule, d’un diamètre d’environ 1,3 µm qui apparaissent en phase G1 et disparaissent en phase S. Ils contiennent les facteurs de transcription Oct-1 et PTF, mais aussi l’ARNpolII, TBP et Sp1, et incorporent le Br-UTP ; ils sont donc transcriptionnellement actifs. Ces domaines sont plus particulièrement associés à certains chromosomes (par exemple le chromosome 1 et le chromosome 6), et pourraient donc, comme le nucléole, concentrer des gènes particuliers dans une région propice à leur transcription.

Le concept d’usines d’assemblage, appliqué à la transcription dépendante de l’ARNpolII, modifie la vision des mécanismes impliqués dans sa régulation. Ce n’est plus le gène qui recrute le complexe de pré-initiation mais plutôt l’usine qui recrute le gène. Les même lois de recrutement sont suivies, puisqu’un gène décompacté est statistiquement plus apte au mouvement et donc au recrutement, et que la présence d’activateurs va augmenter l’affinité du gène pour l’usine. De la même façon, les données biochimiques de la dynamique des protéines dans le noyau peuvent aboutir à une nouvelle approche des régulations.


III.2. La régulation de la transcription des gènes suit la dynamique des protéines :

Les premières expériences d’extinction de fluorescence (photobleaching) effectuées sur le noyau ont permis de montrer que la diffusion des molécules au sein du noyau est diminuée de 4 fois par rapport à une solution aqueuse (Fushimi and Verkman, 1991). L’utilisation d’étiquettes GFP (Green Fluorescence Protein) permet aujourd’hui d’observer en direct le mouvement des protéines dans la cellule. Les nouvelles techniques d’allumage/ extinction de fluorescence permettent des études cinétiquement très précises. Les conclusions de ces études sont qu’il existe un réel flux des molécules dans le noyau, notamment au sein des zones interchromatiques (Misteli et al., 2000 ; Pederson, 2000). Ce flux n’est dû qu’à la diffusion des molécules, n’étant dépendant ni de l’ATP, ni d’une température physiologique. Les protéines étudiées sont retardées par rapport à la GFP seule, car elles participent à des interactions de haute affinité avec d’autres molécules.

Les protéines structurales de la chromatine, comme les histones ou les protéines du groupe HMG (High Mobility Group), sont généralement considérées comme stablement fixées à l’ADN. Cette théorie semble exacte pour les histones nucléosomales (H2, 3 et 4), ces protéines restant fixées sur la chromatine plusieurs heures (Misteli, 2001). Par contre, l’étude de fusion H1-GFP montre qu’en fait cette protéine circule au sein du noyau tout en restant fortement liée à la chromatine, le cycle de fixation/diffusion de H1 étant estimé à 1-2 mn de fixation pour un temps de diffusion très court (Lever et al., 2000; Misteli et al., 2000). Au contraire, les facteurs de transcription ont un comportement très dynamique et s’échangent très rapidement (fixation de quelques secondes) (McNally et al., 2000; Stenoien et al., 2001).

La dynamique des protéines (architecturales ou non) dans le noyau et notamment leur stabilité sur l’ADN constitue un facteur essentiel dans la régulation des gènes. En effet, un facteur peu stable sur son site de fixation, augmente l’accessibilité d’un autre facteur pour ce site, alors qu’un facteur très stable est peu remplaçable. Les modifications post-transcriptionnelles régulant la stabilité des protéines (phosphorylation, acétylation...) sont donc critiques pour l’expression des gènes. Le recrutement des protéines sur leur cible pourrait ainsi être déterminé par des interactions stochastiques, l’activation (ou l’inhibition) d’un gène consistant à augmenter (ou à diminuer) la probabilité de fixation d’un facteur activateur, et/ou à diminuer (augmenter) la probabilité de fixation d’un facteur architectural. Ce modèle permettrait d’expliquer la rapidité des réponses cellulaires face à un stimulus, l’augmentation quantitative même modeste d’une protéine modifiée, élevant significativement la probabilité qu’elle a de trouver sa cible (Misteli et al., 2000).


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