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Les papillomavirus et la régulation de la transcription

Auteur : Dr. Isabelle BOUALLAGA

Institut Pasteur - Unité "Expression génétique et Maladies", Département de Biologie du Développement, Paris - France.


Chapitre IV.
Transcription des fonctions transformantes du papillomavirus humain de type 18 :


I. La spécificité tissulaire

II. Les facteurs impliqués :

La région amplificatrice du promoteur précoce de HPV18 s’étend sur 230 pb. Comme nous le verrons dans la partie résultat, l’amplificateur transcriptionnel n’est pas une structure modulaire, ne supportant aucune délétion. De multiples sites potentiels de fixation pour des facteurs de transcription cellulaires peuvent être trouvés par comparaison de séquences, mais peu de sites importants pour l’activité transcriptionnelle ont pu être mis en évidence (Figure 23) (O'Connor et al., 1995a). Seul le site AP1 central à la région est totalement essentiel (Thierry et al., 1992).


Figure 23 : LCR de HPV18. La LCR peut être divisée en trois parties: le promoteur précoce, l’enhancer et une troisième partie moins connue. De nombreux facteurs interagissent avec cette région: les protéines virales E1 et E2, le facteur général de transcription SP1, il y a un site de réponse aux glucocorticoïdes GRE, et d’autres facteurs supposés intervenir dans la spécificité tissulaire comme KRF, Skn-1a/i et TEF. Deux sites AP1 sont présents dans cette région.



II.1. AP1 :

Les protéines de la famille AP1 ont été découvertes lors de l’étude de cancers associés à des virus dont les oncogènes sont des versions modifiées de gènes cellulaires (Maki et al., 1987; Van Beveren et al., 1983 ). La séquence des gènes cellulaires correspondant a révélé leur qualité de facteurs de transcription, notamment par une homologie forte entre le domaine de fixation à l’ADN de Jun et celui de GCN4 (Vogt et al., 1987). Aujourd’hui, cette famille de protéines comporte 7 membres, dont 3 protéines Jun : Jun B, cJun et Jun D, et 4 protéines Fos : cFos, Fos B, Fra-1 et Fra-2, plus deux formes tronquées, issues d’un épissage alternatif pour DFos B et d’une initiation interne pour DJun D.

Ces protéines font partie de la superfamille des facteurs à domaine b-zip, comportant une région basique de fixation à l’ADN, adjacente à un domaine de dimérisation de type glissière à leucine. Les acides aminés situés entre les leucines déterminent la loi d’association entre les différentes protéines ; ainsi les dimères Jun/ Fos sont les plus stables, les dimères Jun/ Jun sont moins stables, et les dimères Fos/ Fos, très instables, n’ont jamais été détectés in vivo (O'Shea et al., 1989; Schuermann et al., 1991; Smeal et al., 1989). Les dimères AP1 contactent l’ADN au niveau du grand sillon sur une séquence spécifique de consensus 5’-TGACTCA-3’. Cette région est appelée TRE (TPA Responsive Element) car identifiée sur le promoteur du gène collagénase comme élément de réponse aux agents chimiques inducteurs de tumeurs, comme le TPA (Angel et al., 1987). Il a également été montré que les protéines Jun et Fos pouvaient se fixer sur l’ADN au niveau des sites palindromiques dits CRE (Cyclic AMP Response Element), de séquence 5’-TGACGTCA-3’, normalement reconnus par les protéines de la famille CREB/ ATF (CRE Binding protein). Cette famille faisant aussi partie de la superfamille des facteurs de transcription à domaine b-zip, ils peuvent hétérodimériser avec les protéines Jun et ainsi augmenter le nombre de combinaisons possibles (Benbrook and Jones, 1990). Les différents dimères ont des affinités variables pour les séquences nucléotidiques constituant le site de fixation, notamment entre les homodimères Jun et les hétérodimères Jun/Fos, il pourrait donc y avoir une spécificité d’action des différents dimères (Hai and Curran, 1991; Ryseck and Bravo, 1991 ).

Le domaine transactivateur des facteurs AP1 est caractérisé par sa richesse en résidus acides. Par ce domaine, mais aussi par leur domaine b-zip, les facteurs AP1 interagissent avec les coactivateurs tels que CBP, SRC-1, ou le coactivateur spécifique du tissu osseux NAC a (alpha chain of the Nascent polypeptide-Associated Complex) (Bannister and Kouzarides, 1995 ; Bannister et al., 1995 ; Lee et al., 1998a; Moreau et al., 1998)... mais aussi avec la machinerie transcriptionnelle via, par exemple, TBP, TFIIB, TAFII250 mais aussi TFIIE et TFIIH (Franklin et al., 1995 ; Lively et al., 2001 ; Martin et al., 1996). L’activité transcriptionnelle de ces facteurs est donc dépendante des affinités différentes des dimères (dimères AP1 ou hétérodimères CREB) pour les facteurs recrutés. La capacité combinatoire des facteurs de transcription AP1 est amplifiée par le fait qu’ils sont régulés post-traductionellement, principalement par phosphorylation (Gupta et al., 1996 ; Kyriakis et al., 1994). Les facteurs AP1 sont donc au centre d’un réseau protéique complexe capable, via de faibles différences d’affinité entre les protéines, de réguler finement l’expression des gènes, notamment lors du cycle cellulaire (Mechta-Grigoriou et al., 2001).

L’amplificateur transcriptionnel d’HPV18 comporte en son centre un site de fixation TRE de séquence 5’-TGACTAA-3’. Des mutations ponctuelles empêchant la fixation des facteurs AP1 sur ce site ont montré que ce site était essentiel à l’activité transcriptionnelle de l’amplificateur (Thierry et al., 1992). L’expression des différents membres AP1 varie avec la différenciation cellulaire, et cette variation participe à la régulation transcriptionnelle des gènes épithéliaux tels que les kératines (Angel et al., 2001). Ainsi, dans les cellules HeLa, qui représentent notre modèle d’étude, ou dans les kératinocytes primaires, Jun B est le membre Jun prédominant (Thierry et al., 1992). J’ai pu montrer que le site AP1 de l’amplificateur transcriptionnel fixait préférentiellement l’hétérodimère JunB/ Fra-2 (Bouallaga et al., 2000).


II.2. Protéines à domaine POU :

Le nom de cette famille de protéines vient du nom des protéines initialement découvertes contenant le même domaine de fixation à l’ADN : Pit-1, spécifique de la glande pituitaire, Oct-1, protéine se fixant à un octamère, et Unc-86 chez Caenorhabditis elegans (Andersen and Rosenfeld, 2001). Le domaine POU est bipartite, contenant un sous-domaine variable à motif homéobox, POU-H, et un sous-domaine conservé et spécifique, POU-S (Sturm and Herr, 1988). Chacun de ces domaines contient un motif hélice-tour-hélice s’associant directement avec chaque hémisite de fixation. Par exemple le site de fixation pour Oct-1, de consensus ATGCAAAT peut-être divisé en ATGC, hémisite fixé par POU-S et AAAT fixé par POU-H (Klemm et al., 1994).

La famille des facteurs de transcription à domaine POU est aujourd’hui représentée par 15 gènes chez les mammifères, classés en 6 groupes par leur homologie de séquence du domaine POU (Andersen and Rosenfeld, 2001). Seul Oct-1 (= Otf-1, NF-A1, NFIII, OBP100, Pou2f1), impliqué, par exemple, dans la régulation des snRNA et de l’histone H2B, est exprimé de façon ubiquitaire, les autres membres ayant tous une spécificité d’organe ou de tissu. Je ne détaillerai donc ici que les membres POU exprimés dans le tissu épithélial. Oct-1, comme Skn-1a/i (= Oct-11, Otf-11, Epoc-1, Pou2f3) font partie du groupe II. Skn-1a/i a un profil d’expression restreint aux kératinocytes de l’épiderme suprabasal (Andersen et al., 1997b). Il est notamment impliqué dans la régulation de la kératine K10, et du promoteur précoce des papillomavirus (HPV1A, 16 et 18), en dehors de l’amplificateur transcriptionnel (Figure 23) (Andersen et al., 1997a ; Yukawa et al., 1996). L’homologie du domaine POU de Skn1a/i avec celui de Oct-1 est suffisante pour qu’ils aient le même site consensus de fixation à l’ADN. Un troisième facteur POU, Tst-1 (= Oct-6, SCIP, Otf-6, Pou3f1), est exprimé dans l’épiderme, où il serait, avec Skn1a/i, impliqué dans la différenciation cellulaire (Andersen et al., 1997b). Tst-1 a un site différent de fixation à l’ADN, de consensus GA(A/T)T(T/A)ANA. Tst-1 est aussi exprimé dans le système nerveux, où son rôle est mieux étudié.

Deux sites de fixation pour le facteur de transcription Oct ont été proposés sur l’amplificateur transcriptionnel de HPV18 (Figure 23) (O'Connor et al., 1995a). L’action de ce facteur de transcription sur l’activité de l’amplificateur transcriptionnel n’est cependant pas claire. Le site Oct situé à proximité du site AP1 (site I) n’est pas présent chez HPV16. Sa séquence est de plus assez éloignée du consensus, et nous verrons qu’il ne fixe pas efficacement la protéine Oct (voir résultats). Le site présent en 3’ de l’amplificateur transcriptionnel (site II) est, lui, essentiel pour l’activité de l’amplificateur de HPV16 (Chong et al., 1991), mais ne semble pas important pour celui de HPV18 (Butz and Hoppe-Seyler, 1993). Les mêmes auteurs ont aussi montré que Oct réprimait l’amplificateur transcriptionnel de HPV18 indépendamment de son site de fixation (Hoppe-Seyler et al., 1991), pourtant nous avons observé qu’une mutation ponctuelle dans ce site inhibait fortement l’activité de l’amplificateur transcriptionnel dans les cellules HeLa (voir résultats).

La mutation du site de HPV16 produirait un effet opposé dans les cellules de carcinome cervicale, où une baisse de l’activité est observée, et dans les autres cellules, où une augmentation de l’activité transcriptionnelle est observée (Morris et al., 1993). Ceci suggère qu’un facteur de la famille POU, présent spécifiquement dans les cellules de carcinome cervicale, comme Brn-3a, participerait à l’activité de l’amplificateur transcriptionnel de HPV18, et peut-être à sa spécificité tissulaire (Hoppe-Seyler et al., 1991 ; Ndisang et al., 2000).


II.3. NFI :

Le facteur NFI (Nuclear Factor I) a initialement été isolé à partir d’un extrait nucléaire de cellules HeLa pour sa capacité à stimuler l’initiation de la réplication des adénovirus (Nagata et al., 1982). Aujourd’hui aussi appelé CTF (CAAT-box Transcription Factor), NFI est impliqué dans la régulation transcriptionnelle d’un grand nombre de gènes contrôlés par la signalisation cellulaire (Gronostajski, 2000).

Les facteurs NFI font partie d’une famille multigénique phylogénétiquement conservée. Quatre gènes existent chez les vertébrés, NFI-A, B, C et X, qui sont eux-mêmes à l’origine de multiples protéines produites par épissages alternatifs. Ils ont cependant une structure commune comportant, dans leur partie Amino-terminale, un domaine de fixation à l’ADN atypique riche en résidus cystéine, et dans leur partie Carboxy-terminale, un domaine transrégulateur riche en résidus proline. Les facteurs NFI se fixent sous forme de dimères (homo- ou hétérodimères) sur l’ADN, sur le site consensus 5’-TTGGC(N)5GCCAA-3’, avec une affinité d’environ 10-11 M, les séquences flanquantes ainsi que les cinq nucléotides internes modulant cette affinité (Gronostajski et al., 1985). NFI peut aussi se fixer sous forme monomérique à un hémisite (TTGGC ou GCCAA), mais avec une affinité réduite, d’environ 10-9 M (Meisterernst et al., 1988).

Le facteur de transcription NFI active la transcription via son domaine C-terminal. Celui-ci contient un heptapeptide correspondant aux répétitions présentes dans le CTD de l’ARNpolII (PTSPSYS). Cette région lui permet d’interagir directement avec les composants du PIC tels que TFIIB, TBP et TAFII55 (Kim and Roeder, 1994 ; Xiao et al., 1994 ). Il interagit aussi avec plusieurs coactivateurs comme CBP/p300, SRC-1 (Chaudhry et al., 1999)... et aurait un effet sur la chromatine, en déplaçant par compétition les histones H1 fixées avec une faible affinité sur les sites NFI (Ristiniemi and Oikarinen, 1989). NFI peut aussi être un répresseur transcriptionnel, principalement par compétition directe avec les transactivateurs se fixant de façon adjacente comme cela a été montré pour SP1, HFN4 et HFN-1 (Nehls et al., 1991 ; Yamada et al., 1997). NFI-X est plus particulièrement impliqué dans la répression.

Plusieurs sites de fixation pour NFI ont été proposés pour l’amplificateur transcriptionnel de HPV18 (Figure 23) (O'Connor et al., 1995a). Ces sites semblent présents chez la plupart des HPVs (Gloss et al., 1989). Pour HPV16, sept sites NFI sont présents, et pourraient intervenir dans la spécificité tissulaire. En effet, NFI exprimé de façon exogène dans la cellule SL-2 n’exprimant pas ce gène, peut activer la transcription d’HPV16 (Apt et al., 1993). Par contre, cette surexpression n’a pas d’effet sur l’activité de l’amplificateur transcriptionnel dans des fibroblastes, qui contiennent principalement le répresseur NFI-X (Apt et al., 1993). Un des sites NFI présents sur l’amplificateur transcriptionnel de HPV16, correspond à un hémisite, adjacent au site Oct de l’extrémité 3’ (O'Connor and Bernard, 1995b). La mutation de ce site conduit à une baisse de 12 fois de l’activité de l’amplificateur transcriptionnel de HPV16. NFI et Oct pouvant se fixer sur l’ADN de façon concomitante, Oct pourrait servir d’ancrage au facteur NFI.


II.4. TEF :

Le facteur TEF-1 a été identifié comme régulateur du promoteur de SV40, se fixant sur les éléments GT-IIC et Sph (###) dans les cellules HeLa, mais pas dans les cellules lymphocytaires MPC11 (Xiao et al., 1991). La protéine TEF-1, de 426 acides aminés, et de poids apparent de 53 kD, contient plusieurs domaines distincts. Le domaine de fixation à l’ADN se trouve dans la partie Amino-terminale : il se compose d’une région riche en résidus sérine et acides (aspartate, glutamate), puis d’une région acide chargée (histidine, lysine, arginine). Il y a ensuite un domaine hydrophobe, pouvant constituer un domaine de dimérisation, riche en résidus proline. Le domaine d’activation, constitué par la moitié Carboxy-terminale, contient une région riche en résidus hydroxylés (sérine, thréonine et tyrosine), et un motif doigt de zinc à l’extrémité. Il peut se fixer sur un site simple de consensus GGAATG, mais a une meilleure affinité pour un site double, se fixant sous forme dimérique (Jiang et al., 2000). Le promoteur de SV40 contient des sites répétés en tandem sur lesquels TEF-1 se fixe coopérativement (Xiao et al., 1991).

TEF-1, tout de même largement ubiquitaire, n’est pas présent dans tous les types cellulaires. Cette spécificité tissulaire est dűe à son expression (régulation de son promoteur ou de la stabilité de son ARNm), mais aussi à la nécessité d’un coactivateur, TIF (Transcriptional Intermediary Factor), lui-même spécifique de tissu. En effet, la surexpression de TEF-1 dans les cellules lymphocytaires MPC11 (qui n’en ont pas) ne suffit pas à l’activation. De plus, dans les cellules HeLa (qui contiennent ce facteur), la surexpression de TEF-1 inhibe la transcription médiée par l’amplificateur transcriptionnel de SV40, suggérant la titration d’un coactivateur. Récemment TDU, un coactivateur de TEF-1, homologue de Vestigial chez la drosophile, a été découvert par son homologie avec Scalloped, protéine interagissant avec Vestigial chez la drosophile (Vaudin et al., 1999).

L’activité transcriptionnelle des papillomavirus génitaux étant restreinte aux cellules épithéliales, notamment issues de carcinome cervical, l’implication de TEF-1 a été recherchée. Plusieurs régions de l’amplificateur transcriptionnel de HPV16 semblent pouvoir fixer TEF-1, comme le montrent des expériences de protection à la DNase I (Ishiji et al., 1992). Une première région, "site II" fixe TEF-1 via une séquence homologue à GT-IIC de SV40, alors que les autres sites de fixation pour TEF-1 présents sur l’amplificateur transcriptionnel ressemblent plus aux sites Sph de SV40, aussi connus pour fixer TEF-1, mais avec moins d’affinité (###). L’utilisation de clones ponctuellement mutés dans les sites I et II, n’étant plus capables de fixer TEF-1, a déterminé l’implication fonctionnelle de ces sites, les mutants ayant perdu de 20 à 25 % de leur activité. Par contre, rien n’est connu des sites de fixation pour TEF-1 chez HPV18.


II.5. Autres sites potentiels :

D’autres sites de fixation ont parfois été décrits, comme déterminants majeurs de la spécificité tissulaire des HPVs.

Tout d’abord le site de fixation pour le facteur KRF-1 (Keratinocyte Restricted Factor-1), qui correspond à une large région en aval du site AP1, a été découvert par des expériences de protection à la DNase I en présence d’un extrait nucléaire de cellules HeLa (Mack and Laimins, 1991). Ce site fixerait un facteur spécifique absent des cellules lymphocytaires BJA-B. Le site KRF-1, découvert sur l’amplificateur transcriptionnel de HPV18, n’est cependant pas conservé. Il est donc peu probable qu’il soit impliqué dans la spécificité tissulaire des virus génitaux. De plus, l’identité du facteur protéique n’a pas été déterminée.

Les facteurs de transcription AP-2 constituent une famille de protéines impliquées dans la régulation de nombreux gènes ayant un rôle dans le développement, le cycle cellulaire et l’apoptose (Hilger-Eversheim et al., 2000). Ils participent notamment à la différenciation de l’épithélium en régulant de façon coordonnée l’expression des différentes kératines (Fuchs and Byrne, 1994). De plus, les facteurs AP-2 seraient liés à l’apparition de cancers mammaires par l’activation du gène c-erbB-2 (Bosher et al., 1995). Ces facteurs se fixent à l’ADN sous forme de dimères (homo- ou hétérodimères) au site consensus GCCNNNGGC. Un site de fixation pour le facteur AP2, de séquence AGGCACATATT a été proposé chez HPV18 (Royer et al., 1991). Cependant, aucun membre de cette famille ne semble avoir d’effet sur les LCR de HPV18 et de HPV16 (Beger et al., 2001).


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