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Introduction aux Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles

Auteur : Dr. Joëlle CHABRY - IPMC, CNRS UMR 6097, Sophia Antipolis, France.


IV. Les deux faces de la PrP.


La totalité de la phase ouverte de lecture des gènes Prnp mammifères et aviaires est localisée sur un seul exon (Basler et al., 1986 ; Gabriel et al., 1992), ce qui élimine la possibilité que la PrPsc soit une conséquence d'épissages alternatifs. Bien que les messagers de la PrP soient exprimés constitutionnellement dans le cerveau des animaux adultes, leur taux est finement régulé au cours du développement. Chez la souris, les messagers de la PrP sont présents dans le système nerveux central, dès le 12ème jour du développement embryonnaire (Manson et al., 1992). Il est important de noter que les taux de messagers de la PrP ne varient pas au cours de l'infection (Chesebro et al., 1985). Dans la mesure où pendant longtemps des anticorps spécifiques de l'une ou l'autre forme de PrP n'étaient pas disponibles, les localisations tissulaire et cellulaire de la PrPc ont été réalisées sur des animaux sains. Les expériences d'immunohistologie de la PrPsc ont été réalisées sur coupes de tissus infectés après digestion par la protéinase K afin d'éliminer la PrPc ; suivie d'une dénaturation chimique pour révéler les épitopes de la PrPsc.


IV.a. PrPc.
Le gène Prnp humain code pour une protéine de 253 résidus qui peut être considérée comme le précurseur de la PrP.

Les modifications post-traductionnelles consistent en quatre étapes principales (Figure 4) :

- le retrait du peptide signal amino-terminal.
- le retrait des vingt-trois résidus de l'extrémité carboxy-terminale et l'addition d'un groupement glycosylphosphatidyl
  inositol (GPI) sur un résidu Asn, permettant l'ancrage de la protéine à la membrane plasmique.
- la formation d'un pont disulfure entre les résidus cystéines 179 et 214.
- l'addition de deux groupements d'oligosaccharides sur les résidus Asn 181 et 197.




Figure 4 : Séquence primaire de la PrP humaine (PrP 23-231).
En grisé, ancre GPI et N-glycosylation. Les cadres verts représentent les hélices a, tandis que les rouges représentent les feuillets b. A pH 7, les résidus notés en rouge portent une charge postive, en bleu une charge négative, les résidus neutres sont notés en violet. Les acides aminés en marron sont hydrophobes, D'après Riesner et al., 2003.


À l'exception de la séquence primaire de la PrP du poulet, la conservation en acides aminés est très importante entre toutes les autres espèces. Dans le domaine amino-terminal de la PrP se trouve une séquence octapeptidique répétée cinq fois. Cette région est remarquablement conservée entre les espèces, suggérant un rôle fonctionnel important. De plus, cette région constitue un site de liaison du cuivre et lie avec une affinité moindre d'autres ions divalents comme le zinc et le manganèse (Brown et al., 1997a ; Jackson et al., 2001). Des copies surnuméraires des séquences octapeptidiques ont été trouvées chez des patients atteints de la forme fCJ (7, 9, 11 copies). Il existe également dans la séquence de la PrP, un domaine hydrophobe qui s'étend du résidu Ala 113 au résidu Gly 127 inclus. Un tel enchaînement de 15 résidus hydrophobes (AGAAAAGAVVGGLGG) est peu commun d'autant que cette séquence est totalement conservée dans tous les gènes Prnp de mammifères. Il existe une mutation ponctuelle A117V, étroitement liée, chez l'Homme, à l'apparition du syndrome de GSS. Cette région apparaît de première importance dans la conversion de la PrPc en isoforme PrPsc ainsi que dans les phénomènes de mort cellulaire.

La structure tridimensionnelle de la PrP recombinante sans son ancre GPI a été obtenue par résonance magnétique nucléaire. Trois hélices a et deux feuillets b structurent la partie carboxy-terminale de la PrP (42 % d'hélice a et 3 % de feuillet b). Le domaine carboxy-terminal de la PrP est globulaire tandis que l'extrémité amino-terminale est flexible et librement mobile (Riek et al., 1996 ; Donne et al., 1997). Il est possible que le domaine amino-terminal de la PrP acquière sa structure définitive après liaison du cuivre ou après insertion de la PrP dans la membrane plasmique via son ancre GPI. En dépit de quelques différences de séquences primaires, les structures tridimensionnelles des PrP recombinantes humaine, murine et bovine se superposent parfaitement n'apportant aucun éclairage nouveau quant à l'existence d'une barrière d'espèce.

Bien que l'expression de la PrPc soit ubiquitaire dans le cerveau, les immuno-marquages les plus intenses sont obtenus dans le bulbe olfactif, le cortex cérébral (à l'exception de la couche 1), les colliculi inférieurs et supérieurs et l'olive. Majoritairement neuronale, la PrPc est plus intensément exprimée dans les neurones GABAergiques (Ford et al.). Dans le cervelet, les messagers de la PrP sont fortement exprimés dans les cellules de Purkinje et se retrouvent à des niveaux plus modestes dans les cellules granulaires. Les études d'immuno-localisation ont montré la présence de la PrPc dans le bouton synaptique des neurones (Fournier et al., 1995). Il est clair que la PrPc se concentre dans des micro-domaines de la membrane plasmique, insolubles dans les détergents, les "rafts" riches en cholestérol et en glycosphingolipides (Gorodinsky and Harris 1996). La PrPc peut être libérée dans le milieu extra-cellulaire au cours d'un processus appelé "shedding" (Parizek et al., 2001 ; Parkin et al., 2004) (Figure 5). Des formes tronquées de PrPc ont été détectées aussi bien dans des extraits de cerveaux humains que dans des neuroblastomes en culture (Chen et al., 1995 ; Shyng et al., 1993). Les activités enzymatiques responsables de cette coupure protéolytique, qui intervient entre les résidus histidine 111 et méthionine 112 de la PrPc humaine, sont ADAM10 et ADAM17 ("A disintegrin and metalloprotease") (Chen et al., 1995 ; Vincent et al., 2001). Les expériences de chasse "pulse chase" ont déterminé un temps de demi-vie de la PrPc d'environ 6 heures (Caughey and Raymond, 1991). La PrPc est internalisée de façon constitutive et induite; cette question est abordée plus en détail dans le paragraphe V.1.b.




Figure 5 : Synthèse, maturation, dégradation et traffic intracellulaire de la PrPc.


Bien que douze années se soient écoulées depuis la création des lignées de souris Prnp0/0 , aucune idée claire ne s'est dégagée quant à la fonction physiologique de la PrPc. Les études phénotypiques des souris Prnp0/0 n'ont révélé que des anomalies neurophysiologiques mineures en relation avec l'excitabilité neuronale et la régulation du cycle circadien (Raeber et al., 1998 ; Tobler et al., 1996). Des "phénomènes de compensation" de fonction, dont on ne sait pas très bien ce qu'ils recouvrent et quelle est leur nature, ont été évoqués. Cependant, les souris transgéniques dont l'expression de la PrPc est abolie après la naissance, ne présentent pas non plus de phénotype particulier (Mallucci et al., 2002). Voilà donc une protéine dont on pouvait s'attendre à ce qu'elle assume un rôle de première importance, eu égard à la conservation de son gène et à son implication dans les ESST, et qui semble totalement superflue. Néanmoins, plusieurs hypothèses plus ou moins fondées ont été avancées :

En raison de l'existence de sites de liaison au cuivre sur la protéine, la PrPc pourrait être un transporteur cuprique (Brown et al., 1997b) ou avoir une activité de type "superoxyde dismutase" (Brown et al., 1999). La PrPc aurait un effet cytoprotecteur notamment en abaissant le contenu cellulaire en radicaux libres. Cependant, in vivo, la concentration en cuivre du cerveau est indépendante du taux d'expression de la PrPc (Waggoner et al., 2000).

En absence de sérum, des neurones de l'hypocampe n'exprimant pas la PrPc sont plus sensibles au stress oxydatif et meurent plus rapidement que des neurones issus de souris sauvages (Kuwahara et al., 1999). La mort par apoptose des cellules Prnp0/0 peut être empêchée par transfection des gènes de la PrP ou du facteur anti-apoptotique Bcl-2. Selon l'interprétation des auteurs, la PrPc pourrait être un modulateur de la cascade moléculaire conduisant à l'apoptose cellulaire.

Une stratégie prometteuse afin de cerner le rôle de la PrPc dans le métabolisme cellulaire normal est la recherche de récepteurs, ligands ou partenaires protéiques. Par la méthode "d'hydropathie complémentaire" , une protéine de 66 kDa capable de lier la PrPc a été identifiée (Martins et al., 1997). Cette protéine, "Stress-inducible protein 1" (STI1), interagissant avec la PrPc induirait un signal de neuroprotection empêchant l'apotose des neurones (Chiarini et al., 2002). Plusieurs protéines candidates ont également été isolées par la méthode de "double hybride" . Cette méthodologie a révélé la possible association de la PrPc avec des protéines impliquées dans l'adhésion et la mobilité cellulaires comme N-CAM, (Schmitt-Ulms et al., 2001) et le récepteur de la laminine ainsi que la protéine de choc thermique Hsp60 (Rieger et al., 1997) et Bcl-2 (Kurschner and Morgan, 1995). Notons que la confirmation de l'existence de ces interactions in vivo n'a pas été formellement démontrée.

Enfin, des souris transgèniques exprimant des formes tronquées de PrP dans sa région amino-terminale (D32-121 et D32-134) ont été créées sur fond génétique Prnp0/0. L'expression de formes délétées de la PrP induit une dégénérescence importante des cellules granulaires du cervelet se traduisant par une ataxie et une mort prématurée des souris. Le mécanisme de cette toxicité n'est pas connu, mais peut être supprimé si la PrPc sauvage est exprimée conjointement aux transgènes délétères (Shmerling et al., 1998). Outre l'importance de l'extrémité amino-terminale de la PrPc, ce modèle expérimental suggère l'existence d'interactions essentielles entre la PrPc et des partenaires cellulaires (Figure 6). La PrPc pourrait jouer un rôle crucial dans la mise en place des différents types cellulaires et le développement harmonieux du cervelet.




Figure 6 : Modèle théorique de l'effet des PrP délétées de leurs extrémités amino-terminales.
La PrPc est composée d'une partie globulaire et d'une partie amino-terminale flexible qui peuvent interagir de façon indépendante avec un récepteur putatif (R) produisant la transduction d'un signal intracellulaire dans la cellule cible. La transduction du signal peut également se produire par interaction de R avec p, une protéine non encore indentifiée partageant certaines propriétés fonctionnelles avec la PrP (schéma de gauche). Ce modèle permet d'expliquer l'absence de signe neurologique grave chez les souris Prnp0/0 (schéma central). La PrP délébie de son extrémité amino-terminale (DPrP) peut interagir avec R faisant compétition avec p mais sans engendrer de transduction du signal (schéma de droite). L'absence de transduction du signal serait à l'origine des effets délétères observés chez les souris transgéniques DPrP.



IV.b. PrPsc.
La séquence primaire de la PrPsc est identique à celle de la PrPc de l'hôte. La résistance à la digestion par la protéinase K varie en fonction de l'espèce hôte et/ou de la souche considérée. Son temps de demi-vie supérieure à 24 heures dans des cellules chroniquement infectées (Caughey and Raymond, 1991). Dans le système nerveux central, la PrPsc ne s'accumule pas systématiquement dans les aires cérébrales les plus riches en PrPc, suggérant un possible transport axonal de la PrPsc. Dans certaines voies, l'infectivité migre le long des axones selon un profil compatible avec le transport rétrograde (Fraser and Dickinson, 1985). Outre le cerveau, la PrPsc a été détectée plus récemment dans des échantillons de rate, de muscles squelettiques et d'épithélium olfactif de patients atteints de sCJ (Zanusso et al., 2003 ; Glatzel et al., 2003).

Comme évoqué précédemment, la PrPsc ne peut provenir que de cerveaux d'animaux ou de cellules infectés et sa purification à homogénéité n'a jamais été atteinte. De plus, la dislocation des agrégats de PrPsc revient à "stériliser" l'agent infectieux. En conséquence, il paraît difficile de mener à bien des expériences de cristallographie et de résonance magnétique nucléaire sur une préparation protéique impure et agrégée. Il est probable que la structure tridimensionnelle de la PrPsc garde, et pour longtemps encore, ses secrets. Néanmoins, les études de spectroscopie en spectre infrarouge, ont montré que les agrégats de PrPsc forment une structure remarquablement ordonnée, constituée de 43 % de feuillets b et 30 % d'hélice a (Caughey et al., 1991b).


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