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Introduction aux Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles

Auteur : Dr. Joëlle CHABRY - IPMC, CNRS UMR 6097, Sophia Antipolis, France.


V. Conversion de la PrP cellulaire en isoforme pathologique.

V.1.b. Influence de la synthèse et du trafic de la PrPc sur l'accumulation de la PrPres.

Annexe 1 : " Specific inhibition of pathological prion protein accumulation by small interfering RNAs "
Daude N, Marella M, Chabry J. J. Cell. Sci. (2003) 116: 2775-79.

En influençant le temps d'incubation de la maladie, le taux d'expression de la PrPc est un élément déterminant de la pathogenèse des ESST. En revanche, la sensibilité à l'infection est indépendante du taux d'expression de la PrPc. En effet, des neuroblastomes exprimant des taux similaires de PrPc peuvent être hautement ou partiellement sensibles à l'infection voire totalement insensibles (Enari et al., 2001). Dans ce modèle cellulaire, la synthèse de la PrPc précède dans le temps, l'accumulation de la PrPsc (Caughey and Raymond, 1991). L'expression de la PrPc étant essentielle à la conversion et à l'accumulation de PrPsc, nous avons étudié l'effet de l'abolition transitoire de l'expression du gène Prnp dans les neuroblastomes chroniquement infectés. L'inhibition spécifique et sélective de l'expression de la PrPc dans des cellules somatiques, est aujourd'hui réalisable grâce à la technologie des "small interfering" RNA (siRNA).

La transfection de siRNA spécifiques de la séquence des messagers de la PrP murine induit une diminution dose-dépendante de l'expression de la PrPc. L'observation en microscopie à fluorescence a permis de montrer que quarante-huit heures après transfection, 85 % des cellules ont reçu les siRNA marqués à la fluoresceine. La synthèse de PrPc et l'accumulation de PrPsc chutent de façon concomitante dans les neuroblastomes infectés (IC50 = 125 mM). Une nouvelle fois, il est intéressant de noter que si la conversion est empêchée par l'absence de substrat (i.e. PrPc), la cellule est capable de dégrader les agrégats de PrPsc. Un travail récent montre l'implication des enzymes à cystéines dans la protéolyse de la PrPsc (Luhr et al., 2004). La méthode de transfection transitoire utilisée ne permet pas une extinction définitive de l'expression de la protéine. En conséquence, après 3 à 4 passages des cellules, le taux d'expression PrPc est rétabli à un niveau normal et l'accumulation de la PrPsc reprend.

L'abolition de l'expression de la PrPc par cette technologie est hautement spécifique. En effet, bien que dans la région concernée, la séquence des messagers de la PrPc ne présente que deux bases différentes, les siRNA spécifiques de la PrPc murine n'inhibent ni l'expression de la PrPc ovine (résultats non montrés), ni l'accumulation de la PrPsc ovine (Figure 7) à pourcentage de cellules transfectées égal.




Figure 7 : Specificité des siRNA.
Les siRNA construits à partir de la séquences des messagers de la PrP murine sont transfectés dans les cellules Rov-9 exprimant la PrP ovine et infectées par une souche de tremblante de mouton.


Annexe 2 : " Filipin prevents pathological prion protein accumulation by reducing endocytosis and inducing cellular PrP release "
Marella M, Lehmann S, Grassi J, Chabry J. J. Biol. Chem. (2002) 277 (28): 25457-64.

Comme nombre de protéines glypiées, la PrPc est localisée dans les "rafts" lipidiques de la membrane plasmique. À partir de la surface cellulaire, la PrPc peut être internalisée, recyclée et dégradée ou alternativement peut se lier aux agrégats de PrPsc et être transformée (pour revue : Lehmann et al., 1999). Les sites sub-cellulaires de la liaison et de la conversion PrPc/PrPsc restent mal définis. Certains auteurs suggèrent que la conversion pourrait avoir lieu dans les "rafts" lipidiques de la membrane plasmique; d'autres incriminent les endosomes précoces. La PrP glypiée, ancrée dans les "rafts" ne peut être convertie que si les agrégats de PrPsc sont insérés en "cis" dans les mêmes membranes (Baron et al., 2002). Une fois formés, les agrégats de PrPsc pourraient rester à la surface cellulaire (Vey et al., 1996) et/ou être internalisés dans les lysosomes (Caughey et al., 1991a).

Comme mentionné précédemment, la PrPc possède dans sa séquence, des sites de liaison au cuivre. De fortes concentrations de cuivre induisent l'endocytose de la PrPc (Pauly and Harris, 1998). Compte tenu de l'ensemble de ces données, il apparaissait intéressant de caractériser avec précision la voie d'endocytose empruntée par la PrPc après stimulation par le cuivre.

Nous avons confirmé clairement l'induction de l'endocytose de la PrPc par le cuivre. L'observation en microscopie confocale et de la co-localisation avec différents marqueurs spécifiques des voies d'endocytose nous ont permis de démontrer que ce phénomène est indépendant de la voie des puits tapissés à clathrine ("coated-pits") mais emprunte la voie dépendante de la cavéoline. Il semble donc que contrairement à l'endocytose constitutive, l'endocytose de la PrP induite par le cuivre, soit médiée par la voie des "caveolae". Par ailleurs, diverses drogues connues pour inhiber sélectivement l'endocytose dépendante de la clathrine (chlorpromazine), ou l'endocytose dépendante des "caveolae" (filipine, nystatine) ont été testées dans nos modèles cellulaires. Seule la filipine est capable d'inhiber l'endocytose de la PrPc induite par le cuivre confortant l'implication des "caveolae". De façon intéressante, nous avons montré qu'en plus de son activité d'inhibition de l'internalisation, la filipine provoque la libération massive de la PrP dans le milieu de culture. Cette libération n'est pas sélective de la PrPc puisque Thy-1, autre protéine résidente des "rafts" , est libérée dans le milieu extracellulaire. Très affine pour le cholestérol, la filipine serait donc capable de destabiliser les "rafts" lipidiques libérant dans le milieu extérieur les protéines présentes.

En théorie, l'inhibition de l'endocytose de la PrPc combinée à sa libération massive de la membrane plasmique devrait entraîner une forte diminution de la quantité de substrat disponible pour la conversion PrPc/PrPsc. Afin de tester cette hypothèse, des neuroblastomes chroniquement infectés par l'agent murin de la scrapie ont été incubés en présence de filipine. Effectivement, la filipine inhibe de façon dose-dépendante la formation de PrPsc dans les neuroblastomes (EC50 = 1,25 mg/ml soit 2 mM). La filipine est un antibiotique polyènique ayant une structure proche de celle de l'amphothéricine B ; cette dernière inhibe également l'accumulation de la PrPsc dans les neuroblastomes (Mange et al., 2000a ; Mange et al., 2000b). Entre nos mains, l'amphothéricine B n'a d'influence ni sur l'endocytose ni sur la libération de la PrPc dans le milieu extracellulaire. Il est intéressant de noter que deux molécules ayant en commun une structure voisine et des propriétés "anti-prions" , ont des mécanismes d'action distincts.

Au cours des ces expériences, aucune toxicité cellulaire de la filipine ou des " si RNA" n'a été mise en évidence dans la gamme de concentrations testées. Ces deux approches ont en commun la diminution de la PrPc exprimée à la surface cellulaire, seul substrat de la conversion. La membrane plasmique semble être le passage obligé de la PrPc avant la conversion. Elles constituent de voies thérapeutiques nouvelles et prometteuses pour bloquer les premières étapes de formation de la PrPsc. Leur utilisation in vivo est, néanmoins considérablement limitée par le passage au travers de la barrière hémato-encéphalique qui constitue un problème non résolu à ce jour.


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