V. Conversion de la PrP cellulaire en isoforme pathologique.

V.2.a. Mécanismes moléculaires de la conversion : apport du système de conversion acellulaire in vitro.

L'hypothèse de la "protéine seule" postule que l'agent infectieux est une forme mal repliée de PrP qui pourrait se répliquer :

- soit en interagissant avec la PrPc et en lui imposant sa propre conformation ; c'est la théorie de " remaniement imposé par la matrice" (template-directed refolding).
- soit par réarrangement complet d'une molécule monomérique et association de molécules de même conformation entre elles, c'est la théorie de la "nucléation".

Aucune de ces deux hypothèses de travail n'a été définitivement validée expérimentalement (Figure 8). En principe, il devrait être possible de reproduire ce processus dans un système entièrement synthétique composé de PrPsc, PrPc et d'éventuels co-facteurs. En conséquence, la génération de novo de l'agent infectieux dans un tube à essai à partir de constituants déterminés est de toute première importance. C'est dans cet esprit que Byron Caughey et ses collaborateurs ont mis au point le premier test de conversion acellulaire (Kocisko et al., 1994).




Figure 8 : Modèles théoriques de conversion.

La conversion in vitro consiste à incuber la PrPc radiomarquée et purifiée avec une matrice composée d'une préparation purifiée de PrPsc issue de cerveaux d'animaux infectés. Dans certaines conditions très strictes de température (37-40° C) et de pH (6-6,5), l'incubation de la PrPc radiomarquée avec la PrPsc froide entraîne la formation de molécules de PrP radiomarquées et résistantes à la digestion par la protéinase K. La réaction de conversion ne nécessite pas de synthèse de nouvelles molécules de PrPc, suggérant qu'une interaction directe protéine-protéine est suffisante pour l'induction de la transformation. En d'autres termes, la PrPsc "impose" à la PrPc, sa conformation et certaines de ses propriétés physico-chimiques (Bessen et al., 1995) dans un processus auto-catalytique. Au cours du temps, le test de conversion in vitro a été amélioré et s'est rapproché de conditions plus physiologiques (concentrations salines, absence de détergents etc; (Horiuchi et al., 1999 ; Baron et al., 2002). Ce test de conversion in vitro a permis de disséquer les mécanismes moléculaires mis en jeu au cours de la transformation, d'étudier l'influence de la séquence primaire sur la barrière d'espèce et a même servi à sélectionner des molécules "anti-prions".

Néanmoins, le pouvoir infectieux de la PrP néo-formée in vitro n'a jamais été démontré. C'est pour cette raison que la PrP néo-formée est souvent désignée par le néologisme PrPres (résistante à la protéolyse) plutôt que PrPsc. En effet, la conversion in vitro se produit uniquement dans des conditions où la matrice de PrPsc de départ est en large excès par rapport à la PrPc (excès molaire compris entre 10 et 100). De plus, le pourcentage de conversion est limité à des rendements sub-stœchiométriques. Seulement 5 à 15 % de la PrPc radiomarquée initialement incubée in vitro et convertie en PrPres. Ni l'allongement du temps d'incubation, ni l'addition de nouvelles molécules de PrPc n'influent sur le rendement de la conversion. La limitation du rendement de conversion pourrait s'expliquer par l'absence, dans le milieu réactionnel, de co-facteurs ou de molécules stabilisant le complexe. Cette hypothèse est étayée par le fait que l'addition de protéines chaperonnes augmente très significativement, le rendement de la conversion in vitro (DebBurman et al., 1997). D'autres familles de molécules pourraient également être des co-facteurs de la conversion ; les glycosaminoglycanes (GAG) et les heparanes sulfate proteoglycanes stimulent la formation de PrPres in vitro (Wong et al., 2001). Enfin, signalons que des molécules d'ARN isolées à partir de cerveaux de souris, stimulent la formation de PrPres in vitro (Deleault et al., 2003). À ce jour aucune étude n'a confirmé l'interaction directe des molécules d'ARN et de PrPc in vivo. Néanmoins, de nombreuses études ont démontré que des acides nucléiques se lient avec une haute affinité et participent à des changements conformationnels de la PrP recombinante (Gabus et al., 2001 ; Moscardini et al., 2002 ; Nandi et al., 2002 ; Adler et al., 2003). Il est donc permis de penser que les molécules d'ARN de l'hôte pourraient catalyser la formation de PrPsc in vivo.

L'identification et la purification des molécules servant de co-facteurs seront des étapes essentielles dans la compréhension du mécanisme moléculaire par lequel la PrPc subit un changement conformation entraînant la pathogenèse. Il deviendra possible de reconstituer in vitro, uniquement à partir d'éléments purifiés, les réactions de conversion et d'amplification de la PrPres et de tester, enfin, l'infectivité. Dans le même dessein, Collinge et ses collaborateurs ont mis au point des conditions expérimentales permettant la transformation in vitro de la PrPc recombinante en une isoforme, nommée bPrP, ayant acquis certaines propriétés physico-chimiques de la PrPsc telles que la résistance à la protéolyse et la propension à l'agrégation (Jackson et al., 1999). Selon les auteurs, cette isoforme pourrait être l'équivalent de l'intermédiaire de conversion PrP*, dont l'existence a été postulée par Charles Weismann (Weissmann, 1991a). Il faudra sans doute faire preuve de beaucoup de patience pour savoir si bPrP, inoculée en quantité suffisante à un animal, est capable de provoquer une ESST.

Au cours de mon séjour au Rocky Mountain Laboratories entre 1996 et 1998, j'ai utilisé le test de conversion in vitro précédemment mis au point par Byron Caughey. Nous avons montré que le processus de conversion se scinde en fait en deux étapes distinctes. La première est une étape de liaison PrPc/matrice de PrPsc. La cinétique de la liaison est rapide ; cette étape ne nécessite pas d'homologie de séquence stricte entre les deux isoformes protéiques. La seconde étape est la conversion à proprement parler. De cinétique lente, la conversion nécessite une parfaite homologie de séquence entre les deux isoformes de PrP notamment dans le domaine hydrophobe central de la PrP. Ces deux étapes d'un même processus laisse supposer l'existence de sites spécifiques de liaison.