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Introduction aux Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles

Auteur : Dr. Joëlle CHABRY - IPMC, CNRS UMR 6097, Sophia Antipolis, France.


V. Conversion de la PrP cellulaire en isoforme pathologique.

V.2.b. Caractérisation des séquences de la PrP impliquées dans la liaison et la conversion.


Annexe 3 : " Specific inhibition of in vitro formation of protease-resistant prion protein by synthetic peptides "
Chabry J, Caughey B, Chesebro B. J. Biol. Chem. (1998) 22; 273 (21): 13203-207.

Annexe 4 : " Species-independent inhibition of abnormal prion protein (PrP) formation by a peptide containing a conserved PrP sequence " Chabry J, Priola SA, Wehrly K, Nishio J, Hope J, Chesebro B. J. Virol. (1999) 73 (8): 6245-50.

Annexe 5 : " Specific binding of normal prion protein to the scrapie form via a localized domain initiates its conversion to protease-resistant state " Horiuchi M, Chabry J, Caughey B. EMBO J. (1999) 18, 3193-3203.


La sélectivité de la liaison PrPc/PrPsc, a été testée en incubant une matrice de PrPsc avec un homogénat cellulaire complexe. De cette "soupe protéique", seule la PrPc se lie spécifiquement aux agrégats de PrPsc. Afin de déterminer les sites spécifiques de liaison de la PrP, des peptides synthétiques de la PrP ont été incubés dans le test de conversion in vitro dans le but de faire compétition à l'interaction PrPc/PrPsc. Ainsi une vingtaine de peptides synthétiques ont été testés pour leur capacité à inhiber la conversion (Figure 9). Seuls les peptides correspondant à la partie centrale de la PrP (région 109 à 140) possèdent cette capacité. D'autre part, aucun peptide synthétique incubé en présence de PrPc radiomarquée ne provoque la formation de PrPres in vitro. Ce résultat est en contradiction avec une étude précédente montrant que le peptide P109-141 en se liant à la PrPc, permet l'acquisition de la résistance à la dégradation par le protéinase K (Kaneko et al., 1995).




Figure 9 : Effet des peptides synthétiques de la PrP sur la conversion in vitro.


Le peptide correspondant à la séquence 119-136 (P119-136) possède la séquence minimale porteuse de l'activité d'inhibition de la conversion (Figure 10). Ce peptide est particulièrement intéressant car sa séquence est totalement conservée dans toutes les espèces où le gène Prpn a été séquencé, exception faite de l'hétérozygotie du codon 129 de la PrP humaine. Le peptide P119-136 est donc potentiellement un inhibiteur universel de la conversion. Cette hypothèse a été confirmée en utilisant des tests de conversion in vitro induits par différentes souches de scrapie; la souche de hamster 263K et les souches de souris Obihiro (court temps d'incubation) et 87V (long temps d'incubation). Dans tous les cas, le peptide P119-136 est capable d'inhiber ces réactions de conversion avec la même efficacité. Même à forte concentration, un peptide plus court (P121-141) n'inhibe pas la réaction de conversion. L'ensemble de ces expériences confirment la spécificité d'interaction du peptide P119-136 et son absence de sélectivité vis-à-vis de telle ou telle souche de scrapie. En se liant à la PrPc, les peptides inhibiteurs de la conversion entrent en compétition avec la PrPsc et empêchent donc la liaison PrPc/PrPsc, première étape du processus de conversion. L'importance de cette région centrale de la PrP a été confirmée par d'autres approches (Holscher et al., 1998).




Figure 10 : Séquence minimale porteuse de l'activité inhibitrice de la conversion.


Le peptide P119-136 a été également testé pour sa capacité à inhiber l'accumulation de PrPsc dans les neuroblastomes murins chroniquement infectés. P119-136 incubé directement dans le milieu de culture des neuroblastomes inhibe de façon dose-dépendante l'accumulation de la PrPsc (IC50 = 11 mM). Le mécanisme d'action de ce peptide n'a pas été étudié en détail, mais selon toute vraisemblance P119-136 pourrait lier la PrPc présente à la surface cellulaire.

Outre les peptides synthétiques, l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-PrP a été d'un grand secours pour cartographier les sites de liaison entre les deux isoformes de PrP. Les anticorps dirigés contre la partie carboxy-terminale de la PrP (épitope 219-232) inhibe la liaison la PrPc/PrPsc. Afin de savoir si les résidus composant l'épitope 219-232, étaient essentiels à la liaison, des délétions carboxy-terminales de la PrPc ont été générées par protéolyse ménagée. La digestion d'environ 2 kDa réalisée à l'aide de carboxypeptidases, a révélé que l'extrémité carboxy-terminale n'est pas indispensable à l'étape de liaison des deux isoformes de la PrP. C'est donc vraisemblablement l'encombrement stérique des anticorps "anti 219-232" qui limite la reconnaissance du site de liaison de la région carboxy-terminale.

L'ensemble de ces expériences suggèrent fortement que les régions centrale et carboxy-terminale de la molécule de PrP constituent tout ou partie du site de liaison PrPc/PrPsc. Au cours du processus de conversion in vitro, les molécules de PrPres nouvellement converties restent fortement liées aux agrégats de la matrice originale. Ces observations orientent plutôt vers la théorie du "remaniement imposé par la matrice" donnant naissance à un agrégat fortement ordonné (Figure 8). En outre, ce travail suggère que la PrPc pourrait être le récepteur cellulaire de la PrPsc et participer activement à la propagation de l'infection entre cellules.


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