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Introduction aux Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles

Auteur : Dr. Joëlle CHABRY - IPMC, CNRS UMR 6097, Sophia Antipolis, France.


VI. Causes de la mort neuronale.

VI.c. Peptides synthétiques de la PrP : modèles d'étude de la neurotoxicité in vivo.

Bien que des petits fragments peptidiques n'aient jamais été retrouvés dans le cerveau de personnes atteintes d'ESST, P106-126 et P118-135 sont deux fragments peptidiques très utilisés pour caractériser des mécanismes de la neurotoxicité. Ces peptides correspondent à la séquence humaine de la partie centrale de la molécule de PrP.

P106-126 possède des propriétés physico-chimiques et biologiques comparables à celles de la PrPsc. Ce peptide présente une structure b, une résistance à la digestion par la protéinase K et une forte propension à polymériser in vitro sous forme de microfibrilles amyloïdes (Selvaginni et al., 1993). Le peptide P106-126 agrégé est cytotoxique sur des cultures de neurones par induction de processi apoptotiques (Forloni et al., 1993). La toxicité du peptide P106-126 est intimement liée à la fois à l'expression de la PrPc par les neurones mais également à la présence de cellules microgliales (Hope et al., 1996), (Brown et al., 1996b). Pour toutes ces raisons, le peptide P106-126 est un modèle de choix pour l'étude des mécanismes moléculaires liant agrégation et neurotoxicité.

Des peptides plus longs sous forme fibrillaire sont également à l'origine de l'induction de la mort neuronale in vivo. C'est le cas du peptide synthétique P89-143 portant la mutation P101L, mutation liée chez l'Homme à l'apparition du syndrome de GSS. Après injection icv à des souris transgéniques porteuses du gène Prnp humain muté P101L, les agrégats de P89-143 induisent une neurodégénérescence sévère similaire au syndrome de GSS (Kaneko et al., 2000). Insistons sur le fait que la transmissibilité de la maladie n'a pas été reportée.

Après injection ICV des fragments peptidiques P106-126 et P118-135 à des souris sauvages, aucun stigmate apoptotique n'a été mis en évidence ; vraisemblablement à cause de la dilution des peptides dans tout le système nerveux central. Pour plusieurs raisons exposées ci-après, le système rétinien offre une alternative intéressante. D'une part, la rétine fait partie intégrante du système nerveux central ; elle est composée des neurones spécialisés, de cellules gliales et microgliales. Les neurones rétiniens des couches ganglionnaire et nucléaire interne expriment fortement la PrPc. D'autre part, la cavité oculaire est un système clos et pauvre en activités protéolytiques limitant ainsi la dégradation ou la fuite du peptide injecté. De plus, les injections intraoculaires sont aisées et l'enregistrement de l'électrorétinogramme (ERG), méthode simple et non invasive, permet d'apprécier l'activité physiologique des cellules rétiniennes. Après adaptation au noir, le tracé typique de l'ERG d'un rat ou d'une souris est composé de deux ondes. L'onde a, négative, est le reflet direct de l'hyperpolarisation des cellules photoréceptrices en réponse à un stimulus lumineux. L'onde a est très résistante aux altérations métaboliques de la rétine comme l'hypoxie. L'onde b, positive, est une composante complexe due à la dépolarisation des cellules rétiniennes des couches nucléaire interne et ganglionnaire ainsi que des cellules de Müller (Figure 12). C'est la variation de la concentration potassique qui entraîne une dépolarisation des cellules rétiniennes et donc la genèse d'une onde positive. C'est sans doute l'onde b qui reflète le mieux l'activité physiologique et la qualité du métabolisme de l'ensemble de la rétine.

L'œil est une voie d'entrée naturelle de l'agent infectieux des ESST notamment chez le mouton. De plus, les greffes de cornée sont une cause avérée du développement de maladie de iCJ. Enfin dans 60 % des cas de sCJ, les patients souffrent de troubles visuels et présentent une diminution sélective de l'onde b de l'ERG. L'ensemble de ces données indiquent que l'œil et la rétine plus particulièrement sont des tissus sensibles à l'infection.




Figure 12 : Histologie de la rétine et origine des ondes a et b.


Annexe 6 : " In vivo cytotoxicity of the prion protein fragment P106-126 " Ettaiche M, Pichot R, Vincent J-P, Chabry J. J. Biol. Chem. (2000) 275 (47): 36487-90.

Cette étude a été possible grâce au savoir-faire, à la technicité et aux connaissances du système oculaire de Mohamed Ettaiche. Une collaboration a donc été initiée afin de répondre à une question non encore résolue: le peptide P106-126 est-il neurotoxique in vivo ?

Différentes concentrations de peptide synthétique P106-126 sous forme soluble ou agrégée ont été injectées dans la chambre postérieure de l'œil de rats anesthésiés. Les conséquences de l'injection des peptides sur la fonction rétinienne ont été appréciées par l'enregistrement systématique de l'ERG des animaux 24 heures, 72 heures et sept jours après injection. Le mécanisme de mort cellulaire a été caractérisé par la méthode de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP-end-labelling) sur coupes de rétines ainsi que par l'analyse de l'ADN rétinien. L'injection intra-vitréale du peptide P106-126 agrégé induit une diminution rapide et irréversible de l'activité physiologique de la rétine rendant les animaux définitivement aveugles. Les deux ondes a et b de l'ERG sont diminuées suggérant l'atteinte des neurones rétiniens des couches ganglionnaire, nucléaire interne et des cellules photoréceptrices. Il faut noter que, contrairement au peptide agrégé, le peptide soluble est inactif, confirmant que la toxicité de P106-126 in vivo est intimement liée à son état d'agrégation. La technique de fragmentation de l'ADN corrobore les résultats précédents. Seul l'ADN provenant des rétines traitées par P106-126 agrégé est fragmenté, signe indubitable d'une mort neuronale par apoptose.

Le modèle rétinien mis au point au laboratoire a donc permis de démontrer pour la première fois la neurotoxicité du peptide P106-126 agrégé in vivo.

Annexe 7 : "In vivo and in vitro neurotoxicity of the human prion protein (PrP) fragment P118-135 independendly of PrP expression " Chabry J, Ratsimanohatra C, Sponne I, Eléna P-P, Vincent J-P, Pillot T. J. Neurosci. (2003) 23: 462-469.




Le peptide P118-135 avait été sélectionné initialement pour ses homologies de séquence avec des peptides issus de la protéine bAPP impliquée dans la maladie d'Alzheimer. À l'instar de ceux-ci, in vitro P118-135 s'insère de façon oblique dans les bi-couches lipidiques des membranes et présente des propriétés fusogèniques (Pillot et al., 1997). La séquence de l'isoforme CtermPrP, qui traverse la membrane a été identifiée et correspond approximativement aux résidus 113 à 135 (Hegde et al., 1999). Dans ce contexte, le peptide synthétique P118-135 paraît être un modèle d'étude intéressant bien qu'initialement, il n'est pas été sélectionné dans le but d'étudier neurotoxicité des formes trans-membranaires de PrP. Le peptide synthétique P118-135 présente une forte toxicité in vitro sur les neurones de rat en culture primaire. Nous avons caractérisé précisément les propriétés neurotoxiques de P118-135 in vivo et in vitro. Afin de profiter de l'existence de souris Prnp0/0 et d'étudier l'influence de l'expression de la PrP sur la toxicité éventuelle des peptides, le modèle rétinien décrit précédemment à été adapté, non sans mal, à la souris.

L'injection intra-vitréale de P118-135 soluble induit dès 24h une diminution importante de l'onde b de l'ERG chez des souris sauvages. En revanche, l'onde a n'est pas modifiée suggérant que la fonction physiologique des cellules photoréceptrices n'est pas altérée. Contrairement à P106-126, l'agrégation du peptide P118-135 n'est pas un pré-requis à l'induction de la mort des cellules rétiniennes. L'analyse histologique des coupes de rétines traitées montre une dramatique désorganisation de la structure rétinienne. Des résultats identiques ont été obtenus après injections intra-vitréales de P118-135 à des souris Prnp0/0, indiquant que l'expression de la PrPc n'a pas d'influence sur la toxicité du peptide. En revanche, un variant du peptide, nommé P118-135q dont la séquence primaire présente une permutation de deux résidus, n'a pas de propriétés fusogèniques et n'est pas toxique in vivo et in vitro.

Des tests de cytotoxicité réalisés sur des neurones issus de souris sauvages ou Prnp0/0, montrent que la concentration de P118-135 soluble capable de "tuer" la moitié des neurones est de 20 mM (EC50). Par ailleurs, les activités caspases 3 et 9 sont stimulées en présence de P118-135 mais pas les activités caspases 1 et 8, suggérant l'implication des mitochondries dans l'induction de l'apoptose. En conclusion, nous avons donc montré qu'un fragment peptidique soluble de la protéine prion présente des propriétés neurotoxiques in vivo et in vitro indépendamment de l'expression de la PrPc. La toxicité de P118-135 semble parfaitement refléter les situations pathologiques dans lesquelles peu ou pas d'agrégats de PrPsc sont formés. Nos expériences suggèrent que des formes de PrPc possédant des topologies ou des localisations sub-cellulaires aberrantes pourraient être à l'origine de tout ou partie de la neurodégénérescence observée dans les ESST.

En résumé, nos études permettent de postuler l'existence de deux voies d'induction de la mort cellulaire au cours des ESST. La première voie est dépendante de l'agrégation et de l'expression de la PrPc; la seconde est indépendante de ces deux facteurs et pourrait induire la perturbation de l'intégrité des membranes cellulaires (plasmique et/ou mitochondriale).


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