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Introduction aux Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles

Auteur : Dr. Joëlle CHABRY - IPMC, CNRS UMR 6097, Sophia Antipolis, France.


VI. Causes de la mort neuronale.

VI.d. Rôle des cellules microgliales dans le processus de mort neuronale.

Annexe 8 : " Neurons and astrocytes respond to prion infection by inducing microglia recruitment "
Marella M and Chabry J. J. Neurosci. (2004) 24(3): 620-627.

Bien que les ESST ne soient pas des maladies neuro-inflammatoires, de nombreuses données de la littérature suggèrent un rôle actif des cellules microgliales dans l'établissement de dommages cérébraux. La présence de cellules microgliales activées au voisinage immédiat des dépôts de PrPsc est un dénominateur commun dans les cerveaux atteints d'ESST. Les cellules microgliales expriment fortement la PrPc et constituent un site cellulaire potentiel de replication de l'agent infectieux. In vitro, la présence de cellules microgliales est indispensable à la neurotoxicité induite par le peptide P106-126 sur des cultures primaires de neurones (Brown et al., 1997a). Chez la souris, les taux des messagers de certaines chemokines et de leurs récepteurs sont augmentés très tôt après l'infection, en particulier le messager de CCR-5, récepteur des chemokines RANTES (regulated on activation, normal T-cells expressed and secreted), MIP1a ?et?MIP1b (macrophages inflammatory protein-1). Sécrétées par de nombreux types cellulaires, les chemokines jouent le rôle prépondérant dans la migration des leucocytes. Les données bibliographiques concernant un rôle des chemokines et de leurs récepteurs dans les maladies neurodégénératives sont très fragmentaires. En particulier au cours des ESST, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent l'attraction de la microglie autour des dépôts amyloïdes sont totalement inconnus.

In vivo, nous avons réalisé des injections intra-vitréales de PrP pathologique issue d'homogénats de neuroblastomes chroniquement infectés. Le protocole de préparation de la PrPsc, mis au point au laboratoire est réalisé en absence de détergent et fait intervenir une étape de protéolyse par la protéinase K. La pureté de la PrPsc ainsi préparée, estimée par coloration au nitrate d'argent de gels d'électrophorèse, est comprise entre 75 et 80 %. Les expériences "contrôles" ont été menées avec des préparations protéiques réalisées à partir de neuroblastomes non infectés selon un protocole identique. Des études d'immuno-histologie sur coupes de rétines ont permis la détection des cellules microgliales présentes différents temps après injection. Dans les conditions physiologiques, les cellules microgliales résidentes de la rétine sont rares, de morphologie étoilée et ramifiée et uniquement localisées dans la couche ganglionnaire. Nous avons montré que 48 heures après injection intra-vitréale d'une préparation de PrPsc issue d'homogénat de neuroblastomes infectés, le nombre de cellules microgliales, détectées à l'aide d'anticorps spécifiques (cd11b, cd45, F4/80) augmente d'un facteur 3,5 dans la rétine. Les couches ganglionnaire, plexiforme interne et nucléaire interne sont plus particulièrement infiltrées par la microglie. La microglie adopte une morphologie amiboïde caractéristique de son état d'activation et de sa capacité de migration. L'injection de solution saline ou d'un homogénat de neuroblastomes sains ne provoque pas d'augmentation significative du nombre de microglies dans la rétine. De façon intéressante, l'ajout de 40 mM de TAK-779, un antagoniste non peptidique du récepteur CCR-5, limite considérablement le recrutement des cellules microgliales induit par la PrPsc. Ces résultats suggèrent que le récepteur CCR-5 est impliqué dans la migration des cellules microgliales rétiniennes après infection In vivo.

Les aspects quantitatifs et cinétiques ont été abordés in vitro grâce à la mise au point des tests de chemo-attraction en chambre de Boyden (Figure 13). Dans ce modèle, des cellules microgliales sont cultivées sur filtre de porosité déterminée sans contact direct avec les neurones corticaux ou les astrocytes ensemencés dans les puits de culture sous-jacents. Ces expériences ont été réalisées en parallèle avec une lignée de cellules microgliales murines, les cellules N11, et des cellules microgliales murines en culture primaire.




Figure 13 : Test de migration en chambre de Boyden.


In vitro, nous avons montré que la PrPsc n'a pas de pouvoir chemo-attractant intrinsèque. En effet, l'incubation de PrPsc seule, en absence de cellule dans la chambre inférieure, n'induit pas de migration de la microglie. En revanche, la migration des cellules microgliales est stimulée lors de l'incubation de PrPsc sur des neurones corticaux ou des astrocytes en culture primaire. La cinétique et l'amplitude de la chemo-attraction sont directement proportionnelles à la quantité de PrPsc incubée. La lignée microgliale N11 et les cellules microgliales murines en culture primaire répondent de façon similaire au stimulus. Dans les mêmes conditions expérimentales, ni la PrPc, ni une préparation protéique issue de neuroblastomes sains n'ont de pouvoir chemo-attractant. La chémo-attraction microgliale est indépendante de l'expression de la PrPc. En effet, les tests de chemo-attraction en chambre de Boyden réalisés en présence de neurones corticaux et de cellules microgliales issus de souris Prnp0/0 ne présentent aucune différence significative (résultats non publiés).

Les niveaux de messagers de certaines chemokines ont été estimés en utilisant des techniques de PCR semi-quantitatives. Nous avons montré que l'incubation de PrPsc sur des neurones et des astrocytes stimule la synthèse des messagers de certaines chemokines. Parmi les chemokines testées, celles dont les messagers sont le plus fortement induits sont RANTES pour les neurones et MIP1b pour les astrocytes (facteurs de stimulation respectifs: 6,62 +/- 1,57 et 5.59 +/- 2,21). De façon intéressante, ces deux chemokines activent le même récepteur CCR-5. Des anticorps monoclonaux, neutralisant RANTES, ainsi que l'antagoniste TAK-779 inhibent de façon dose-dépendante la chemo-attraction induite in vitro par la PrPsc confirmant le rôle central de CCR-5 dans le phénomène de migration de la microglie (Figure 14). La famille des chemokines est extrêmement vaste, d'autres membres de la famille pourraient également être impliqués dans le recrutement de la microglie. Dans le cerveau de souris infectées, l'immuno-réactivité de la fractalkine (CX3CL1) est fortement augmentée dans les astrocytes (Hughes et al., 2002). L'expression du récepteur de la fractalkine (CX3CR1) est augmentée dans les cellules microgliales et diminuée dans les neurones.

Finalement, ayant migrées à proximité des cellules nerveuses en contact avec la PrPsc, quelles fonctions les cellules microgliales assument-elles ?

Plusieurs hypothèses peuvent être émises :
- la microglie participe à l'élimination des agrégats protéiques par phagocytose.
- la microglie devient site de réplication de l'agent infectieux et participe à sa dissémination dans l'ensemble du cerveau voire de l'organisme.
- entrant en état d'activation, la microglie synthétise des facteurs cytotoxiques solubles qui participe à la mort neuronale.

Au laboratoire, des études préliminaires ont été initiées afin d'explorer ce dernier point. Pour cela, les cellules N11 ont été incubées en présence de PrPsc, puis le milieu de culture, centrifugé à haute vitesse afin d'éliminer les éventuels agrégats protéiques et débris cellulaires, a été incubé sur des cultures primaires de neurones. Ce milieu de culture "pré-conditionné" induit la mort des neurones corticaux en l'absence de tout contact direct entre les deux types cellulaires. Le taux d'oxyde nitreux synthétisé par des cellules microgliales N11 augmente d'un facteur 6 en présence de PrPsc par rapport aux conditions contrôles. L'oxyde nitreux n'est probablement pas le seul facteur toxique mis en jeu au cours de l'activation des cellules microgliales. Les radicaux libres et certaines cytokines ont également été proposés dans ce rôle (Brown et al., 1996a ; Brown et al., 1996b).




Figure 14 : Les cellules microgliales dans les ESST.



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