RÉSULTATS :

ARTICLE 1 :

Clivage et relocalisation de la tyrosine kinase p59Fyn au cours de l'apoptose des lymphocytes T induite par Fas.

Cleavage and relocation of the tyrosine kinase p59Fyn during Fas-mediated apoptosis in T lymphocytes.

Jean-Ehrland Ricci, Laurence Maulon, Frederic Luciano, Sandrine Guerin, Antonia Livolsi, Bernard, Jean-Philippe Breittmayer, Jean-François Peyron and Patrick Auberger.

Résumé de l'article paru dans la revue "Oncogene" en 1999, vol. 18, p 3963-3969 :

L'apoptose est un processus physiologique qui intervient dans le développement normal d'un organisme. Bien que de nombreux stimuli soient capables d'induire l'apoptose, il existe une famille de récepteurs spécialisés dans la transmission des signaux conduisant à la mort cellulaire programmée. Fas/CD95/APO-1 représente l'archétype de ce type de récepteur de mort. Suite à la stimulation par son ligand (Fas ligand) ou par un anticorps anti-Fas, le récepteur s'oligomérise puis initie une cascade d'événements qui aboutit à l'activation de protéases apoptogènes appelées caspases. Une fois activées, les caspases clivent un nombre limité de substrats clés impliqués notamment dans la régulation de la survie et dans le maintien de l'intégrité cellulaire. Les caspases ont une spécificité stricte de clivage de leurs substrats après un résidu acide aspartique. Elles peuvent être subdivisées en deux familles : la famille homologue à l'ICE (ou caspase 1) qui est inhibée par le tétrapeptide Ac-YVAD-CHO et la famille homologue à CPP32 (ou caspase 3) qui est inhibée par l'Ac-DEVD-CHO.
Le récepteur Fas recrute un certain nombre de protéines, notamment la protéine adaptatrice FADD capable de lier les caspases 8 et 10, mais également d'autres protéines telles que RIP (protéine kinase), FAP-1 (protéine phosphatase) ou encore p59Fyn (tyrosine kinase).
Sachant d'une part que p59Fyn est associé au récepteur Fas et d'autre part que les lymphocytes issus de souris Fyn-/- sont résistants à l'apoptose induite par Fas, nous nous sommes intéressés, dans cette étude, au devenir de la kinase au cours de l'apoptose induite par Fas.
Nous avons tout d'abord remarqué que la kinase était clivée en un fragment de 57 kDa au cours de l'apoptose induite un anticorps anti-Fas (CH11). La cinétique de clivage de Fyn est parfaitement superposable aux cinétiques d'activation de la caspase 3 et de clivage de PARP. Il est à noter que dans les mêmes conditions, ni Lck ni Syk, deux tyrosines kinases cruciales pour l'activation des lymphocytes T, ne sont clivées.
L'utilisation d'inhibiteurs de caspases (Ac-DEVD-CHO et Ac-YVAD-CHO) nous a également permi de démontrer que Fyn était clivé par une caspase de la famille CPP32. Nous avons identifié le site de clivage de Fyn EERD19/G20 par mutation ponctuelle de l'Asp19 en Ala et nous avons vérifié à la fois in vitro et in vivo que cette mutation ponctuelle était capable d'inhiber ce clivage. Finalement nous avons démontré par des méthodes biochimiques (fractionnement subcellulaire) et en microscopie confocale que la forme tronquée de Fyn (57 kDa) était relocalisée de la membrane plasmique vers l'intérieur de la cellule où elle s'accumule dans le cytoplasme et/ou dans des structures microsomales non encore caractérisées.
En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier la tyrosine kinase p59Fyn comme nouveau substrat des caspases. Sachant que Fyn a la capacité de s'associer avec des protéines qui lui sont spécifiques et que les cellules T issues de souris Fyn-/- sont résistantes à l'apoptose induite par Fas, nous proposons que le clivage et la relocalisation de Fyn puissent moduler l'activité de protéines impliquées dans les phases de régulation ou d'exécution de l'apoptose.

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ARTICLE 2 :

Fyn est absolument nécessaire à l'activation des caspases et à l'apoptose induite par l'engagement du récepteur T.

An Absolute requirement for Fyn on T cell receptor-induced caspase activation and apoptosis.

Jean-Ehrland RICCI, Valérie LANG, Fréderic LUCIANO, Frédérique MICHEL, Georges BISMUTH and Patrick AUBERGER.

Résumé de l'article paru dans la revue "Faseb Journal" en 2001, vol. 15, p 1777-1779 :

Le programme apoptotique est orchestré par les caspases qui clivent un nombre limité de substrats clés impliqués dans le maintien de la survie cellulaire. Toutes les caspases sont synthétisées sous forme de zymogènes et sont activées par clivage successif. Des études récentes ont décrit le clivage et l'activation des caspases suite à une stimulation du récepteur T (TCR), démontrant donc que l'activation des caspases est une réponse physiologique à la stimulation du TCR. De plus, l'activation des caspases n'est pas uniquement requise pour l'induction de l'apoptose mais semble être aussi impliquée dans les premières étapes de prolifération et d'activation des lymphocytes T. Nous avons établi dans une précédente étude (Article 1) que la tyrosine kinase p59Fyn, qui est associée au TCR, est clivée par les caspases après l'Aspartate 19, dans les cellules T stimulées par un anticorps anti-Fas, ce qui conduit à la relocalisation de la kinase active p57Fyn de la membrane vers le cytosol. Plusieurs études ayant suggéré que les tyrosines kinases p59Fyn et p59Lyn sont nécessaires à l'induction de l'apoptose des lymphocytes B, ainsi qu'à l'induction de l'apoptose des cellules endothéliales microvasculaires par la thrombospondine-1, nous nous sommes intéressés à l'implication de Fyn dans l'activation des caspases et l'apoptose induite par l'engagement du TCR.
Nous avons vérifié que p59Fyn sauvage (WT) était clivée suite à la stimulation du TCR. De plus, nous avons noté l'absence de clivage de p59Fyn dans les cellules d'hybridomes T de souris surexprimant des formes inactives (KD) et solubles (DN-ter) de Fyn, dans les mêmes conditions de stimulation. L'implication des caspases dans le clivage de Fyn WT a été confirmée grâce à l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques des caspases Ac-DEVD-CHO et le z-VAD-fmk.
Afin de préciser le rôle de Fyn dans l'apoptose induite par la stimulation du TCR nous avons utilisé des hybridomes T murins (cellules T8.1) transfectés de manière stable avec différentes constructions plasmidiques comportant Fyn WT, ainsi qu'une forme inactive (Fyn KD) et une forme soluble (Fyn DN-ter) de la kinase. Nous avons ainsi pu démontrer que la surexpression de la forme sauvage de Fyn induit une augmentation d'un facteur 2 de l'activité caspase induite par un anticorps anti-CD3 réticulé.Les formes KD et DN-ter de Fyn abolissent l'activation des caspases, induite par l'anticorps anti-CD3. Ces résultats indiquent donc que l'activation des caspases consécutive au recrutement du TCR nécessite une forme de Fyn qui soit à la fois active et exprimée à la membrane.
Nous avons ensuite analysé si l'activation des caspases induite par un anticorps anti-CD3 pouvait conduire à la fragmentation de l'ADN des différents clones de cellules T8.1 dont nous disposions. Le clone surexprimant la forme WT de Fyn présente une augmentation significative de la fragmentation d'ADN après stimulation du récepteur T (TCR) si on la compare aux cellules parentales. En revanche, dans les mêmes conditions de stimulation, les cellules exprimant les formes KD et DN-ter ne présentent que peu ou pas de fragmentation d'ADN caractéristique de l'état apoptotique des cellules.
Finalement, nous avons étudié la réponse de fibroblaste de souris embryonnaires (MEF) et de thymocytes issus de souris Fyn-/- à divers stimuli pro-apoptotiques. Nos résultats indiquent que les cellules issues des souris déficientes pour Fyn sont très peu ou pas sensibles à l'action apoptogène de la staurosporine, de l'étoposide, du céramide-C2 ou d'un anticorps anti-CD3. Ceci supporte donc l'idée que Fyn joue un rôle majeur dans l'induction de l'apoptose.

En définitive, nos résultats indiquent d'une part que p59Fyn est clivée suite à l'activation des caspases induite par l'engagement du TCR et d'autre part que cette activation nécessite une forme non seulement active mais également membranaire de la tyrosine kinase. Nous proposons que le clivage de Fyn, suite à la stimulation du récepteur T, puisse agir comme un modulateur de l'apoptose en générant une forme soluble de la kinase capable de se lier et de délocaliser une ou plusieurs molécule(s) impliquées dans l'activation des lymphocytes T.

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ARTICLE 3 :

Caractérisation d'un variant de cellules T Jurkat résistant à l'apoptose induite par les récepteurs de mort, Rôle de hsp27 et hsp70.

Characterization of a Jurkat cell variant resistant to death receptor-mediated apoptosis, Role of hsp27 and hsp70.

Jean-Ehrland RICCI, Laurence MAULON, Corine BERTOLOTTO, Frédéric LUCIANO, Veronique BATTAGLIONE-HOFMAN, Bernard MARI, Paul HOFMAN and Patrick AUBERGER.


Résumé de l'article paru dans la revue "Eur Cytokine Netw." en 2001, vol. 12(1), p 126-134 :

La mort cellulaire programmée ou apoptose est un processus fondamental et indispensable au cours du développement cellulaire, de l'homéostasie tissulaire et de la régulation des réponses immunes. L'apoptose se caractérise par de profond changement morphologiques comprenant une réduction du volume cellulaire, un bourgeonnement de la membrane plasmique, une condensation nucléaire et finalement une fragmentation internucléosomale de l'ADN. Une grande variété de stimuli peuvent induire une réponse apoptotique tels que les récepteurs de la familles du TNF (TNF-RI et Fas par exemple), les radiations U.V., la génération de radicaux libres, les chocs thermiques et de nombreuses drogues comme la staurosporine, le céramide-C2 ou l'étoposide par exemple. L'apoptose est étroitement correlée à l'activation de protéases apoptogènes ou caspases. Les caspases sont synthétisées sous la forme d'une pro-enzyme inactive. L'activation du zymogène est la consequence de plusieurs clivages séquentiels. Une fois activées, les caspases vont cliver différents substrats impliqués, notamment, dans le maintien de l'intégrité cellulaire.
Le récepteur Fas fait partie des récepteurs de mort. Il joue un rôle central dans la modulation de la réponse immune. Une fois engagé, le récepteur Fas recrute différentes protéines ce qui conduit à l'activation en cascade des caspases.
De nombreuses molécules sont impliquées dans la régulation de l'apoptose, telles que les membres de la famille Bcl-2, les proto-oncogènes Myc, Fos et Jun, la tyrosine kinase p59Fyn et les protéines de choc thermique (hsp27, hsp60 et hsp70). Les hsps, sont impliquées dans la résistance des cellules à divers stress comme l'élévation de température ou la génération de radicaux libres oxygénés. La surexpression de hsp27 et de hsp70 protège les cellules de l'apoptose induite par Fas ou la staurosporine.
Nous disposions d'un clone (clone Jr) totalement insensible à l'apoptose induite par Fas et Trail mais présentant une sensibilité équivalente aux cellules parentales (Jd) à différent agents pro-apototiques ciblant la mitochondrie tels que la staurosporine, l'étoposide ou le céramide-C2. Nous avons, dans un premier temps, comparé le niveau d'expression d'un certain nombre de protagonistes centraux de l'apoptose tel que le récepteur Fas, la protéine adaptatrice FADD, certains membres de la famille Bcl-2 (Bcl-2, Bax) ou encore certaines caspases (2, 3, 6, 7, 8, 10). Aucune différence significative dans l'expression de ces protéines n'est réellement en mesure d'expliquer la résistance du clone Jr à l'effet pro-apoptotique des ligands de mort. Sachant que les protéines du chocs thermiques (hsp27 et hsp70 notamment) sont impliquées dans la résistance à l'effet apoptotique de Fas, nous nous sommes naturellement intéresses au rôle potentiel de ces protéines dans la résistance à l'apoptose des cellules Jr. Nous avons constaté que le clone Jr exprimait, environ 3 fois plus de hsp70 par rapport aux cellules Jd et une très forte expression constitutive de hsp27. Il est à noter, par ailleurs, que le niveau de hsp60, qui n'est pas impliquée dans la résistance des cellules à l'apoptose, ne varie pas d'un type cellulaire à l'autre. Nous avons par la suite constaté qu'une pré-incubation des cellules Jd à 42°C était capable d'induire non seulement une résistance importante à l'apoptose induite par Fas mais également à celle stimulée par la staurosporine.
En définitive notre étude indique qu'une expression constitutive de hsp27 et hsp70 est capable d'inhiber l'apoptose induite par les récepteurs de mort alors que seul la forme induite de Hsp70 protége efficacement l'apoptose induite par d'autres stimuli pro-apoptotiques (staurosporine). Nous proposons donc que hsp27 et hsp70 inhibent l'apoptose à une étape critique de la voie de signalisation de Fas et des agents ciblant directement la mitochondrie probablement au niveau du complexe moléculaire associé au récepteur et/ou de l'apoptosome, respectivement.

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ARTICLE 4 :

Le clivage du facteur de réponse au sérum, durant l'apoptose induite par les récepteurs de mort, se traduit par l'inhibition de l'activité du promoteur c-FOS.

Cleavage of the serum response factor (SRF) during death receptors-induced apoptosis results in an inhibition od the c-fos promoter transciptional activity.

Corine BERTOLOTTO, Jean-Ehrland RICCI, Frédéric LUCIANO, Bernard MARI, Jean-Claude CHAMBARD and Patrick AUBERGER.


Résumé de l'article paru dans la revue " J. Biol. Chem. " en 2000, vol. 275, p 12941-12947 :

Les signaux générés à la surface cellulaire influencent l'activation de nombreux gènes cellulaires qui, en retour, vont affecter de nombreux processus physiologiques. Les gènes précoces, dont c-Fos fait partie, sont induits quelques minutes après l'application de stimuli mitogénes, tels le sérum, les esters de phorbol ou encore les facteurs de croissance. L'induction du gène c-FOS dépend d'un élément de réponse au sérum (ou SRE) qui se situe dans sa région promotrice. Deux facteurs de transcription : SRF (Serum Response Factor) et TCF (Ternary Complex Factor) peuvent lier le SRE et ainsi stimuler l'activité transcriptionnelle du promoteur c-FOS. SRF possède dans sa partie centrale un domaine de liaison à l'ADN ainsi qu'un domaine de dimérisation et dans sa partie C-terminale un domaine de trans-activation, nécessaire pour l'induction d'une réponse activatrice complète. Deux voies distinctes convergent vers SRF afin de moduler l'activité transcriptionnelle du promoteur c-FOS. La première aboutit à la phosphorylation des protéines TCF et à la stimulation de leur activité transcriptionnelle, alors que la deuxième est indépendante de TCF mais requiert SRF et nécessite l'activité des petites GTPase de la famille Rho.
La mort cellulaire programmée ou apoptose est un mécanisme physiologique qui permet d'éliminer les cellules superflues ou potentiellement dangereuses de l'organisme. Un dysfonctionnement des processus apoptotiques est lié à l'apparition de diverses pathologies telles que le cancer, et les maladies neurodégénératives ou auto-immunes. L'activation des protéases apoptogènes, ou caspases, est une étape centrale conduisant à la mort cellulaire programmée. Ces caspases, une fois activées, vont dégrader un nombre limité de substrats impliqués dans la régulation et le maintien de l'intégrité cellulaire.
Dans cette étude nous avons analysé l'effet de différents effecteurs de mort cellulaire sur l'expression de c-FOS, en utilisant comme gène rapporteur la luciférase couplée à un promoteur minimum c-FOS. Nous avons notamment montré que l'induction de l'apoptose par TRAIL ou par un anticorps anti-Fas (CH11) inhibe spécifiquement l'activité transcriptionnelle de c-FOS. Ainsi, il est possible que l'effet inhibiteur de ces deux effecteurs de mort affecte une des protéines susceptibles de se lier à la séquence SRE du promoteur c-FOS.
En accord avec cette hypothèse nos résultats indiquent également que, dans les cellules T, les phases précoces de l'apoptose sont caractérisées par le clivage d'une ou plusieurs protéine(s) se liant au SRE et par la diminution de l'activité promotrice de c-FOS. Il est à noter que le clivage d'une ou plusieurs protéine(s) se liant au SRE précède toujours la fragmentation de l'ADN.
Finalement, nous avons identifié SRF comme étant un nouveau substrat des caspases, à la fois in vivo et in vitro. Le clivage de SRF aboutit à la délétion de la partie C-terminale de la protéine. Il est à noter que le clivage de SRF, la diminution de l'activité du promoteur c-FOS ainsi que l'apoptose induite par Fas et TRAIL peuvent être inhibés par un ester de phorbol, le PMA. Des résultats préliminaires indiquent que cet effet protecteur du PMA est dépendant à la fois de la voie p42/44MAPK et de l'activité des PKC. Nous proposons que le clivage de SRF et l'inhibition de l'expression de c-FOS représentent une étape importante dans l'exécution du programme apoptotique des cellules T Jurkat.