DISCUSSION ET PERSPECTIVES :

Ce travail de thèse est une contribution à la caractérisation des mécanismes de transmission du signal par les récepteurs de mort et le récepteur T. Ces études nous ont conduit d'une part à éclaircir les processus impliqués dans la résistance d'un variant des cellules Jurkat vis-à-vis de l'apoptose induite par les récepteurs de mort (Fas ou récepteurs de Trail) et d'autre part à explorer le rôle de la tyrosine kinase p59Fyn dans la modulation de l'apoptose.

Nous avons notamment caractérisé un variant de cellules Jurkat (clone Jr) totalement insensible à l'apoptose induite par Fas ou Trail alors qu'il présente une sensibilité presque équivalente aux cellules parentales (Jd) une fois stimulé par des agents pro-apoptotiques ciblant directement la mitochondrie (i.e. indépendant des récepteurs de mort) (cf. Article 3). Nous avons dans un premier temps comparé, le niveau l'expression d'un certain nombre de protagonistes centraux de l'apoptose tels que le récepteur Fas, la protéine adaptatrice FADD, certains membres de la famille Bcl-2 (Bcl-2, Bax) ou encore les caspases 2, 3, 6, 7, 8 et 10. En définitive, aucune différence significative dans l'expression de ces différentes protéines n'était, à ce niveau de notre étude, en mesure d'expliquer la résistance du clone Jr à l'effet pro-apoptotique des ligands des récepteurs de mort. Compte tenu du fait qu'il est bien établi que les protéines de stress (hsp27 et hsp70 notamment) sont impliquées dans la résistance à l'effet apoptotique de Fas, nous avons déterminé le niveau d'expression de ces protéines. Nous avons constaté que Jr exprime, de manière constitutive, un taux 2 à 3 fois supérieur de hsp70 et un taux très supérieur de hsp27 en comparaison du clone parental. Il est à noter que le niveau de hsp60, hsp non impliquée dans la résistance des cellules à l'apoptose, ne varie pas d'un type cellulaire à l'autre. Nous avons par la suite constaté qu'une pré-incubation des cellules Jd à 42°C était capable d'induire non seulement une résistance importante à l'apoptose induite par Fas, mais aussi à l'effet apoptotique de la staurosporine. En définitive, notre étude suggère qu'une expression constitutive de hsp27 et de hsp70 est capable d'inhiber l'apoptose induite par les récepteurs de mort alors que seules les formes induites de ces protéines et notamment hsp70 sont capables de protéger efficacement contre l'apoptose déclenchée par d'autres stimuli pro-apoptotiques.

Bien que la ou les " cibles " de hsp27 et de hsp70 reste(n)t toujours inconnue(s) à ce jour, il est possible que l'effet inhibiteur des protéines du stress cible un des protagonistes clés de la voie conduisant à l'apoptose. Une étude récente a rapporté qu'une interaction directe entre hsp27 et la caspase 3 pourrait rendre compte de l'effet protecteur de hsp27. Nous n'avons pour notre part jamais été en mesure de constater une telle interaction dans nos modèles cellulaires.

Suite à ces diverses études, il nous a semblé que, non seulement l'expression, mais aussi l'état d'oligomérisation des protéines de stress puissent jouer un rôle crucial dans l'effet protecteur observé. En effet, il est possible que l'état d'oligomérisation des hsps puisse être une des explications rendant compte de la protection supplémentaire apportée par les formes induites au cours d'un choc thermique (i.e. résistance à l'apoptose induite par la staurosporine des cellules Jr pré-incubées à 42°C). Des expériences préliminaires nous ont permis de montrer par des techniques chromatographiques que hsp70 était présente dans des fractions de poids moléculaire élevé, fractions contenant notamment la molécule Apaf-1 et la caspase 9, mais peu ou pas hsp27. Cette distribution particulière de hsp70 pourrait rendre compte de son interaction avec une ou des protéine(s) constitutive(s) de l'apoptosome telle qu'Apaf-1 ou la caspase 9. Il sera nécessaire d'identifier les partenaires de hsp70 d'un point de vue moléculaire en utilisant des techniques de co-immunoprécipitation par exemple. Il serait fort intéressant de renouveler ces études suite à un choc thermique afin de déterminer l'éventuel changement d'état d'oligomérisation de ces protéines et son influence sur les interactions avec l'apoptosome.

Un autre point particulièrement intriguant est la présence dans la séquence des protéines homologues à hsp70 d'une séquence C-terminale de quatre acides aminés EEVD qui est essentielle, notamment, pour la protection contre le choc thermique (Wang et al., 1993, Freeman et al., 1995). Cette séquence présente de fortes homologies avec un site consensus de clivage par les caspases. Nous pouvons imaginer que hsp70, grâce à l'intermédiaire de cette séquence, puisse lier soit une caspase, soit un membre constituant l'apoptosome et que cette interaction soit capable de verrouiller la voie conduisant à l'apoptose. De plus, il est intéressant de noter que cette séquence est homologue à la séquence du site de clivage présent sur la tyrosine kinase p59Fyn clivée par les caspases (EERD¹⁹/G²⁰ Article 1). Dans ce contexte, une relation entre les protéines du stress (hsp27 notamment) et l'activité des membres de la famille Src a été récemment établie. Cette relation entre les hsps et les membres de la famille Src reste toute fois à confirmer et à approfondir. Nous pouvons imaginer qu'une hsp puisse lier et moduler l'activité d'un membre de la famille Src ayant un rôle central dans la régulation de l'apoptose. p59Fyn ferait un excellent candidat... (cf. Article 1 et 2).

Afin de mieux caractériser les différences potentielles entre les clones Jd et Jr, j'ai réalisé une étude d'expression différentielle par criblage de filtres à ADN (DNA array). Après analyse des 4800 gènes connus déposés sur nos filtres, une dizaine de gènes seulement se sont avérés être exprimés de manière différentielle dans les deux variants cellulaires. Parmi ces gènes il convient de citer Pak1 (p21 activated kinase, kinase impliquée dans la voie du stress), PiP2 phosphatase ou encore MIPEP (une peptidase mitochondriale). Après avoir vérifié par Northern Blot les niveaux des ARNm correspondant à ces protéines, il sera intéressant de les réintroduire dans le clone déficient afin de déterminer le rôle respectifs de ces protéines dans la résistance ou la sensibilité à l'apoptose des cellules Jr et Jd. De façon étonnante nous n'avons pas pu mettre en évidence de différence d'expression des protéines du stress par la technique de DNA array. Nous avons vérifié par Northern Blot l'expression de l'ARNm de hsp27 et avons constaté qu'il n'y a aucune différence en terme d'expression quantitative des transcrits de hsp27 dans les clones Jd et Jr. En revanche, les transcrits présentent des tailles différentes dans les deux clones cellulaires. Sachant d'une part que les séquences de hsp27 obtenues à partir de ces clones sont identiques (vérifiées par séquençage) et d'autre part que les protéines possèdent un poids moléculaire apparent identique, il existe probablement des différences dans les régions 3' ou 5' non-codantes. Ces régions rendent peut-être compte de la stabilité de ces transcrits et donc de l'expression constitutive de hsp27 dans les cellules Jr. Il serait donc intéressant de comparer les demi-vies des messagers de hsp70 et hsp27.

Une preuve définitive de l'implication de hsp27 et/ou hsp70 dans la résistance du clone Jr à l'apoptose pourrait être amenée en inhibant l'expression de ces protéines grâce à l'utilisation de séquences anti-sens ou en bloquant directement ces hsps en utilisant à l'aide par exemple, d'anticorps spécifiques introduits dans la cellule par micro injection ou par pinocytose.

Il convient de signaler la parution de trois articles très intéressants montrant élégamment que hsp27 interfère directement avec le cytochrome C (Bruey JM et al., 2000) et que hsp70 (Beere HM et al., 2000) et hsp90 (Pandey P et al., 2000b) interagissent avec Apaf-1.


Parallèlement à cette étude, je me suis intéressé à l'implication de la tyrosine kinase p59Fyn dans l'apoptose. Suite à une étude décrivant d'une part l'association de Fyn au récepteur Fas et indiquant d'autre part que les thymocytes issus de souris Fyn-/- sont insensibles à l'apoptose induite par Fas (Atkinson et al., 1996), nous avons émis l'hypothèse que cette tyrosine kinase pourrait jouer un rôle dans la modulation de la mort cellulaire programmée. Nos résultats indiquent que Fyn est clivée en position 19 de la séquence EERD¹⁹/G²⁰ au cours de l'induction de l'apoptose générant un fragment de 57 kDa. Ce clivage est dépendant des caspases et induit la relocalisation de la kinase sous une forme active de 57 kDa de la membrane vers le cytosol et/ou vers des organelles intracellulaires (Article 1). Des études en microscopie confocale utilisant des anticorps spécifiques nous ont permis de montrer que Fyn, une fois clivée, est relocalisée vers le cytoplasme de la cellule. Cependant le même type d'études utilisant des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques de la mitochondrie ou du cytosquelette, ou encore l'utilisation de mitochondries purifiées, n'ont pas permis d'identifier de manière convaincante la localisation précise de la forme clivée de Fyn. De plus, une étude en collaboration avec Serge Manié à Lyon, a d'une part, confirmé que p59Fyn était localisée dans les " radeaux " lipidiques dans les cellules non traitées et d'autre par qu'une fois clivée dans les conditions apoptotiques, Fyn quitte les " radeaux " et se redistribue à la fois dans la fraction soluble mais également dans la fraction contenant les noyaux, le cytosquelette et les organelles intracellulaires. Ce résultat suggère qu'une proportion non négligeable de Fyn clivée pourrait s'associée spécifiquement à des structures intracellulaires restant à identifier.

Finalement, des études récentes ont décrit une activation des caspases suite à l'engagement du récepteur T (TCR) (Alam et al., 1999; Kennedy et al., 1999). Dans la mesure où une faible proportion de Fyn est constitutivement associée au TCR, nous avons vérifié l'implication éventuelle de cette kinase dans l'activation des caspases par le TCR (Article 2). Grâce à l'utilisation d'hybridomes T transfectés de manière stable par différentes formes de Fyn, nous avons constaté que Fyn sauvage était clivée suite à une stimulation du TCR par un anticorps anti-CD3 immobilisé. Ce clivage est inhibé par un traitement des cellules avec les inhibiteurs Ac-DEVD-CHO (Dubrez et al., 1996) ou z-VAD-fmk confirmant l'implication des caspases dans ce clivage. Il est à noter que dans les mêmes conditions de stimulation, ni la forme inactive (kinase dead) ni la forme soluble (délétée des 6 premiers acides aminés) de Fyn ne sont clivées. De plus, nous avons établi que la surexpression d'une forme sauvage de Fyn induisait une augmentation de l'activité caspase après l'engagement du TCR par comparaison aux cellules parentales. Par contre, la transfection d'une forme inactive ou soluble de Fyn est capable d'abolir l'activation des caspases. Ces résultats démontrent qu'une forme à la fois active et membranaire de la kinase est nécessaire pour l'activation des caspases suite à la stimulation du TCR.

Nous avons également vérifié que l'activation des caspases pouvait conduire à la fragmentation de l'ADN dans les différents clones d'hybridomes T. Il s'est avéré que le clone surexprimant une forme sauvage de Fyn présentait une fragmentation de l'ADN plus prononcée que celle obtenue dans les cellules parentales. En revanche, les clones exprimant les formes KD ou solubles de Fyn ne présentent que peu ou pas de dégradation de l'ADN en réponse à une stimulation du TCR.

Finalement, nous avons étudié la réponse de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) et de thymocytes issus de souris Fyn-/- à divers stimuli pro-apoptotiques. Nos résultats indiquent que les MEFs issus des souris nullozygotes pour Fyn sont peu ou pas sensibles à l'action apoptotique de la staurosporine, de l'étoposide et du céramide-C2. De la même manière les thymocytes de souris Fyn-/- sont résistant à l'apoptose induite par la stimulation de TCR. Nos résultats sont en accord avec la notion d'un rôle majeur la tyrosine kinase Fyn dans l'induction de l'apoptose et dans la modulation de l'activation des caspases induite par l'engagement du TCR.

Une étude de l'équipe de M.D. Resh a rapporté que Fyn, contrairement à Src par exemple, était très rapidement (1 à 4 minutes) associée à la membrane plasmique suite à sa synthèse. Cette observation implique qu'il existe peu ou pas de Fyn libre à l'état basal dans les cellules COS ou NIH 3T3 (van't Hof et Resh, 1997). Nous pouvons donc imaginer que la cellule met en place un tel mécanisme pour éviter l'association de Fyn avec un partenaire cellulaire au cours de sa biosynthèse. De plus, il est à noter qu'une étude de l'équipe de Daniel Hoessli rapporte que les molécules de Fyn localisées au niveau des " radeaux " lipidiques présentent une activité accrue en comparaison avec les molécules Fyn situées hors de ces domaines (Ilangumaran et al., 1999). Nos résultats suggèrent qu'après l'activation des caspases, Fyn est clivée et par conséquence délocalisée des " radeaux " lipidiques vers l'intérieur de la cellule.

Deux hypothèses seraient à même de rendre compte du rôle de Fyn dans l'apoptose :

i) Dans la première hypothèse, Fyn jouerait son rôle hors des radeaux. Ainsi, Fyn une fois relocalisée sous forme active, pourrait interagir avec un substrat spécifique impliqué dans l'activation des lymphocytes T et par conséquent empêcher l'amplification de la cascade d'activation des caspases conduisant à l'apoptose.

ii) Dans une deuxième hypothèse, le rôle de Fyn se situerait au niveau des " radeaux ". A l'état de repos de la cellule, Fyn serait présente sous forme inactive au niveau des " radeaux ". Une fois le TCR stimulé (par un anti-CD3), Fyn serait activée et pourrait ainsi phosphoryler un substrat important pour l'activation des caspases. Les caspases en retour pourraient cliver Fyn qui serait éliminée des " radeaux " ce qui aurait pour conséquence de stopper le signal.

Plusieurs substrats cellulaires ont été décrits pour s'associer spécifiquement à Fyn et à aucun autre membre de la famille Src, (cf. fin du paragraphe III-1b) comme par exemple la PKCq (Ron et al., 1999) et FYB (da Silva et al., 1997). Afin d'identifier le(s) partenaire(s) privilégié de Fyn, nous pourrions notamment préparer des extraits de cellules transfectées par les différentes formes de Fyn après stimulation par un anticorps anti-CD3. Les interacteurs potentiels de Fyn soluble pourraient être identifiés après incubation en présence de protéines SH2-GST, SH3-GST ou SH4-GST de Fyn. Après co-précipitation, ce(s) partenaire(s) pourrait(ont) être identifié(s) par micro-séquençage par exemple.
L'effet de la forme soluble de Fyn (Fyn DN-ter) sur l'activation des caspases est tout à fait originale. En effet, la surexpression de cette forme de Fyn inhibe l'activation des caspases consécutive à l'engagement du TCR (comme la forme inactive). De plus, il est à noter que cette activation des caspase est également bloquée en présence d'un agent pro-apoptotique puissant comme la staurosporine. Le mécanisme d'action de la forme soluble est totalement inconnu à ce jour. Il parait très important d'analyser plus en détail l'effet inhibiteur de la forme soluble, par exemple, en générant des constructions de Fyn délétées mais également mutées sur leurs domaines SH2 ou SH3 (DN-mSH2 et DN-mSH3). La surexpression d'une forme non clivable de Fyn (D19A) dans les cellules T8.1 devrait également permettre de mieux comprendre la manière dont Fyn module l'apoptose.


Afin de compléter cette étude, il sera essentiel de vérifier si une stimulation complète du TCR, grâce à l'engagement d'un co-récepteur (anticorps anti-CD28 par exemple) aboutit à une activation différente des caspases.

Trois possibilités sont alors envisageables :

i) Le co-signal (CD28) n'engendre pas de modification de l'activité des caspases comparé à l'anti-CD3 utilisé seul. Ceci implique que la stimulation du TCR par l'anti-CD3 produit, à elle seule, une activation maximale des caspases;

ii) Le co-signal aboutit à une augmentation de l'activité des caspases. Ceci implique que dans des conditions d'activation optimale du lymphocyte T, il y a bel et bien activation des caspases. Cela conforterait l'idée que les caspases ne sont pas seulement impliquées dans l'apoptose mais aussi dans la régulation de l'activation et de la prolifération cellulaire (Kennedy et al., 1999 ; Alam et al., 1999);

iii) Le co-signal conduit à une diminution de l'activité des caspases. Cette hypothèse impliquerait que l'activation des caspases est une réponse à une stimulation partielle du TCR conduisant à l'anergie ou à l'apoptose.
Il sera important de mesurer, en parallèle, la production d'IL-2 dans les mêmes conditions afin de vérifier que le co-signal induit une activation optimale des lymphocytes T.
Dans le même ordre d'idée, il sera important de stimuler les lymphocytes T de manière plus physiologique par l'intermédiaire d'une CPA présentant un peptide antigénique spécifique afin d'analyser si non seulement un engagement du TCR mais aussi l'intervention d'autres molécules co-activatrices jouent un rôle dans le mécanisme d'activation des caspases.

Ce mécanisme pourrait expliquer, au moins en partie les événements précoces conduisant à l'activation, à l'anergie ou à l'apoptose des lymphocytes T. On peut imaginer que le destin des lymphocytes T est lié à la nature de la kinase de la famille Src engagée au niveau du TCR (Lck ou Fyn). En accord avec cette hypothèse, un article récent de l'équipe de David Straus rapporte que contrairement à Lck qui autorise une réponse complète du TCR, Fyn conduit à une signalisation incomplète indépendante de l'activation de ZAP-70 et génère un type de réponse cellulaire différent, ressemblant à l'anergie (Denny et al., 2000).

Finalement, des études récentes menées au laboratoire par Frédéric Luciano indiquent que le clivage de certains membres de la famille Src pourrait être un mécanisme général impliqué lors de l'apoptose. En effet, nous avons montré que Lyn et Hck étaient également clivées suite à une stimulation du récepteur Fas dans différentes lignées cellulaires (lignées B et myélomonocytaires). La cinétique de clivage de Lyn est plus rapide et plus complète que celle de Fyn. Le fragment libéré est d'environ 54 kDa ce qui serait compatible avec un clivage de cette kinase au niveau du site DGVD¹⁸/L¹⁹ qui est très semblable à celui de Fyn (EERD¹⁹/G²⁰). Les expériences très ressentes de mutation de ce site confirment que se clivage se produit bien après l'Asp¹⁸.

Hck (59 kDa), pour sa part, apparaît après clivage sous la forme d'un fragment unique à 45 kDa. Le site potentiel de clivage se situerai, du côté C-terminal de la molécule au niveau du site catalytique. Il est à noter que le clivage de Hck, bien que sensible aux inhibiteurs de caspases, est constitutif dans les lignées myélomonocytaires. Ils semble donc que le clivage de Hck soit dû à une autre protéase elle-même activée par les caspases au cours de l'apoptose. Le clivage par les caspases n'est cependant pas une généralité dans la famille des Src kinases puisque ni Lck ni Src ne sont clivées in vitro et in vivo par les caspases. D'autre part nous avons également monté que les tyrosines kinases de la famille Syk (ZAP-70 et Syk) ne sont pas clivées par les caspases in vitro et in vivo.

Ainsi, les membres de la famille Src pourraient être sub-divisés en deux sous-familles, les membres clivables ou non par les caspases. Cette caractéristique pourrait rendre compte de fonctions particulières de ces membres de la famille Src ne serait-ce que par leur capacité à se délocaliser suite à leur clivage par les caspases. Enfin, il conviendra à l'avenir d'étudier l'importance des différents membres de la famille Src dans la modulation l'apoptose induite par la stimulation du TCR et compte tenu du clivage de Lyn, du BCR.