Trois approches différentes ont conduit à la détection, la purification et le clonage de la protéine gp95-sortiline/NTR3 :


1 - L'utilisation d'un analogue radioactif et photo-activable de la NT a initialement permis la détection d'une protéine de masse moléculaire apparente 100 kDa, par marquage d'affinité, lors de tentatives de solubilisation de récepteurs de la NT sous forme soluble et active (23). Cette protéine, solubilisable par le détergent CHAPS, s'est avéré capable de lier la NT avec une forte affinité (Kd = 0,2 nM) et son profil pharmacologique vis-à-vis de nombreux analogues de la NT est identique à celui ds récepteurs membranaires de la NT (23). La protéine de 100 kDa liant la NT a été ensuite purifiée à partir de cerveau de souris et humain (24, 25), tout en conservant exactement les propriétés qui avaient été observées avec l'extrait solubilisé par le détergent CHAPS. Plus tard, le récepteur de la NT de 100 kDa a été montré, sur des neurones en culture primaire, comme étant impliqué dans l'internalisation du peptide NT, au même titre que deux autres récepteurs membranaires de la NT (26). Cette étude a permis d'avancer l'hypothèse que la protéine de 100 kDa est absente de la surface cellulaire et que sa translocation vers la membrane plasmique était la conséquence de l'internalisation des deux autres récepteurs membranaires de la neurotensine (de 50 et 60 kDa) qui ont pu être mis en évidence sur ces neurones (26).


2 - Durant l'étude des caractéristiques de liaison de la protéine RAP (receptor-associated protein) aux récepteurs des lipoprotéines de faible densité (LDL), une glycoprotéine de masse moléculaire apparente 100 kDa a été détectée dans les vésicules intracellulaires comportant la protéine RAP (27, 28). RAP est une protéine endoplasmique de 40 kDa localisée au niveau du réticulum et de l'appareil de Golgi, et qui joue un rôle important dans la maturation des récepteurs des LDL (29). Le domaine carboxyterminal de RAP a été montré capable de lier le domaine Vps10p d'une nouvelle protéine, la sortiline (30). RAP se lie aussi à la calmoduline est peut être phosphorylé par la calmodulin-dependent kinase II et la caséine kinase II (31). La liaison de RAP à des récepteurs, au sein de compartiments intracellulaires est vraisemblablement impliquée dans la prévention de l'agrégation et de la liaison prématurée de ligands potentiels aux récepteurs des LDL (32, 33). De même, RAP est impliquée dans la prévention de la rétention dans le réticulum endoplasmiques, comme le montre l'inactivation ciblée (knock-out) du gène RAP de souris, chez lesquelles l'expression des récepteurs des LDL à la membrane cellulaire se trouve fortement affectée (34). L'utilisation d'une colonne d'affinité sur laquelle a été fixée la protéine RAP, Petersen et collaborateurs ont pu identifier, purifier et caractériser une protéine de 95 kDa à partir de cerveau humain, en ytilisantune technique de solubilisation au CHAPS, voisine de ce qui avait été réalisé pour les récepteurs de la NT (18). Finalement, l'étude des protéines liant la RAP greffée sur une colonne d'affinité (18) et une étude utilisant une colonne d'affinité sur laquelle a été greffée la NT (17) ont abouti au clonage séparé d'une même protéine montrant une structure caractéristique des récepteurs de type I, avec des homologies avec la protéine Vps10p de levure et les récepteurs cation-dépendants et cations-indépendants du mannose-6-phosphate.


3 - La purification immunologique de vésicules intracellulaires contenant le transporteur du glucose Glut4 a permis à Lin et collaborateurs d'identifier une protéine de 110 kDa comme étant l'un des composants protéiques majeurs de ces vésicules (35). Le clonage moléculaire de cette protéine chez le rat, réalisé à partir d'adipocytes, a révélé une identité forte de séquence (de l'ordre de 93 %) avec la sortiline humaine, ce qui a porté à considérer cette protéine comme l'analogue de la sortiline chez le rat.