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Distribution subcellulaire des récepteurs du glutamate de type kaïnate

Auteur : Dr. Frédéric JASKOLSKI
Adresse actuelle : MRC Centre for Synaptic Plasticity - Department of Anatomy - University of Bristol - UK.


RESULTATS :



Les résultats sont présentés sous la forme de trois publications comme suit :

Publication 1 :

"Subunit composition and alternative splicing regulate membrane delivery of kainate receptors"
Jaskolski, F; Coussen, F; Nagarajan, N; Normand, E; Rosenmund, C; Mulle, C.
Journal of Neuroscience, 2004

Publication 2 :

"Membrane delivery of GluR7 kainate receptor splice variants"
Jaskolski, F; Normand, E; Mulle, C; Coussen.
Manuscrit soumis

Publication 3 :

"An automated method to quantify and visualize co-localized fluorescent signals"
Jaskolski, F; Mulle, C; Manzoni, OJ.
En révision, Journal of Neuroscience Methods



Résultats :
"Subunit composition and alternative splicing regulate membrane delivery of kainate receptors"
Jaskolski, F; Coussen, F; Nagarajan, N; Normand, E; Rosenmund, C; Mulle, C.
The Journal of Neuroscience, March 10, 2004 o 24(10): 2506 -2515

Il existe différents variants d'épissage des sous-unités GluR5 et GluR6 des récepteurs kaïnate, GluR5a, GluR5b, GluR5c, GluR6a et GluR6b. Cet article rapporte les résultats obtenues concernant l'adressage membranaire de ces variants d'épissage :

1) Les sous-unités GluR5a, GluR5b et GluR6b sont faiblement exprimées à la surface des cellules COS-7 et des neurones d'hippocampe en culture.

2) Toutes les isoformes des sous-unités GluR5 et GluR6 sont détectées dans les axones et les dendrites des neurones

3) La sous-unité GluR5c exprimée seule n'est pas détectable sur la surface des cellules. Cette sous-unité est strictement retenue dans le réticulum endoplasmique par un motif de type " RXR ".

4) La sous-unité GluR6a est majoritairement exportée du réticulum endoplasmique vers la membrane plasmique. L'adressage membranaire de cette sous-unité dépend d'un groupement d'acides aminés basiques qui se trouve dans son domaine C-terminal.

5) L'utilisation de souris invalidées pour les gènes codant les sous-unités GluR5 et GluR6 a permis de montrer que l'association d'une sous-unité retenue dans le réticulum endoplasmique avec la sous-unité GluR6a permet l'export de l'hétéromère vers la membrane plasmique.

Ces résultats indiquent que l'assemblage et l'épissage alternatif sont deux paramètres qui régulent l'adressage des récepteurs kaïnate vers la membrane plasmique.


Résultats supplémentaires :




Supplemental data 1 :

Epitope tagged GluR5 and GluR6 isoforms form functional homomeric channels. Epitope-tagged GluR5 and GluR6 isoforms were transfected in HEK 293 cells to test for their electrophysiological response to glutamate (10mM). Representative traces of currents evoked by fast application (represented by the black upper line) in whole-cell recordings for GluR5a and GluR5b, and in outside-out patches for GluR6 isoforms, scale bars, 200ms and 200pA. No current was activated for the GluR5c isoform which is not expressed at the cell surface.





Supplemental data 2:

Deglycosylation assay performed on brain protein extracts from transgenic mice expressing GluR6a-myc (Coussen et al, 2002). Enzymatic digestion and western blotting was performed as described (see Methods). GluR6a-myc is partly sensitive to EndoH and fully deglycosylated by PNG-F, as in transfected COS-7 cells. The predicted unglycosylated molecular weight is indicated by the black arrowhead.





Supplemental data 3

Cotransfection of GluR5b with GluR6a, GluR7a, KA1 or KA2. To test whether GluR5 preferentially coassembles with GluR7, KA1 or KA2 rather than with GluR6, we have cotransfected COS-7 cells with tagged GluR5b in combination with untagged GluR6a, GluR7a, KA1 and KA2. Surface expressed GluR5 subunits are shown in red, intracellular staining in green. GluR6a and GluR7a, but not KA1 or KA2, strongly enhance surface expression of GluR5b. Scale bar: 10 m.
"Membrane delivery of GluR7 kainate receptor splice variants"
Jaskolski, F; Normand, E; Mulle, C; Coussen.
Manuscrit soumis

Il existe deux variants d'épissage du C-terminal de la sous-unité GluR7, GluR7a et GluR7b. Dans cet article nous rapportons les résultats obtenus concernant l'adressage membranaire des sous-unité GluR7a et GluR7b :
1) La sous-unité GluR7a est plus efficacement adressée vers la membrane plasmique que la sous-unité GluR7b.
2) Les deux isoformes de la sous-unité GluR7 sont détecté dans les axones et les dendrites des neurones. 3)
Le motif de type " RXR " porté par la sous-unité GluR7 n'est pas impliqué dans la rétention de cette sous-unité dans le réticulum endoplasmique. 4)
La sous-unité GluR7a porte dans son domaine C-terminal le même motif d'adressage que la sous-unité GluR6a. 5)
La sous-unité GluR7a permet le trafic vers la membrane plasmique de sous-unités qui sont retenues dans le réticulum endoplasmique. 6)
L'épissage alternatif des sous-unités GluR6 et GluR7 régule l'assemblage des récepteurs kaïnate.

L'épissage alternatif de la sous-unité GluR7 régule l'assemblage et l'adressage membranaire des récepteurs kaïnate.
"An automated method to quantify and visualize co-localized fluorescent signals"
Jaskolski, F; Mulle, C; Manzoni, OJ.

Pour étudier la distribution subcellulaire des récepteurs kaïnate, la principale méthode utilisée dans ce travail de thèse est l'immunocytochimie de fluorescence. Cette technique permet entre autre de comparer la distribution de deux marqueurs afin d'établir le lien spatial qui existe entre eux. Cette approche repose principalement sur une lecture qualitative du recouvrement des marquages. Cet article décrit une méthode que nous avons développé pour permettre une lecture quantitative de la colocalisation de deux marqueurs fluorescents.
1) La méthode est basée sur le calcul du produit des écart à la moyenne pour chaque pixels appariés.
2) Nous pouvons produire une image de corrélation à partir des deux images initiales. 3)
La méthode permet de calculer la fraction de recouvrement des signaux fluorescent ainsi qu'un indice de corrélation global pour une paire d'image. 4)
La mesure de colocalisation n'est que faiblement affectée par le bruit de fond. 5)
Nous avons éprouvé notre méthode sur des images simulées et des expériences d'immunocytochimie.

Cette méthode d'analyse de colocalisation autorise une lecture quantitative et objective de la colocalisation en imagerie de fluorescence.


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