Deuxième partie : Les récepteurs de la neurotensine :

I - Le NTR1 :

I - A - Le gène :

- Description :
Un ADNc de 3,6 kb, codant pour un récepteur de la neurotensine de haute affinité, a été isolé par expression dans l'ovocyte de xénope à partir d'une banque d'ARNc de cerveau de rat (Tanaka et al., 1990). Les auteurs ont utilisé la propriété qu'ont les ovocytes injectés avec des ARNm de cerveau de rat, de répondre à une application de NT par un courant chlore (Parker et al., 1986).

L'ADNc humain correspondant a ensuite été cloné (Vita et al., 1993) par expression dans les cellules COS-7, à partir d'une banque d'ADNc de cellules HT29 (adéno-carcinome de côlon humain présentant une activité de liaison de haute affinité pour la neurotensine, (Kitabgi et al., 1980) et criblage par la ¹²⁵I-Tyr¹¹-NT. Sa séquence protéique (418 acides aminés) est identique à 84 % à celle du rat. Plus récemment, ce récepteur présent dans les neuroblastomes de souris (Poustis et al., 1984) a également été cloné dans le cerveau de souris (Genbank, G3551525).

Le séquençage complet du gène chez l'homme (Le et al., 1997) a permis de montrer la présence de trois introns, et d'une séquence tétranucléotidique répétée très polymorphe, en aval du site de polyadénylation. La région 5'contient plusieurs sites putatifs de liaison pour des facteurs de transcription, et une séquence de régulation négative (Tavares et al., 1999). Ceci suggère que la régulation de l'expression de ce gène implique la coordination complexe de facteurs promoteurs et inhibiteurs.

Chez la souris, le gène a été localisé sur le chromosome 2, bande H et chez l'homme sur le bras long du chromosome 20 (Laurent et al., 1994). Cette localisation présente un intérêt particulier si l'on met en rapport le fait que d'une part des délétions de q20 sont associées à de graves désordres cérébraux et que d'autre part de nombreux arguments tendent à prouver l'implication de la NT dans certaines schizophrénies (Garver et al., 1991; Nemeroff et al., 1989; Wolf et al., 1995).

- Transcription du gène et traduction du messager
Les études par Northern-blot réalisées à partir d'ARNm isolés de différents tissus chez l'homme et chez le rat montrent l'existence d'un transcrit d'environ 4 kb, présent aussi bien dans le cerveau que dans le tractus digestif (Tanaka et al., 1990; Vita et al., 1993).

Les phases de lecture des ADNc de rat et d'homme codent pour des protéines d'environ 47 kDa qui présentent 84 % d'homologie entre elles (Figure 17).

Chez l'homme, un polymorphisme qui ne modifie pas les propriétés de liaison du peptide a été identifié sur l'acide aminé 194 (leucine/phényl alanine) (Watson et al., 1993).
Ausi bien in vivo que in vitro, l'expression du gène du NTR1 se traduit toujours par la synthèse de deux formes protéiques de poids moléculaire proche. Ainsi, in vitro, dans un lysat de réticulocytes de lapin, l'ADNc codant pour le NTR1 de rat génère deux protéines de 44 et 47 kDa (Botto et al., 1997d) ; l'expression stable du NTR1 de rat dans les fibroblastes de souris, se traduit par la synthèse de deux protéines de 50 et 60 kDa (Chabry et al., 1994) ; dans des cellules COS-7, deux protéines de 47 et 50 kDa sont synthétisées (Botto et al., 1997d) ; dans des membranes de cerveau de rat nouveau-né, un anticorps anti-NTR1 a permis de mettre en évidence deux protéines de 54 et 56 kDa (Boudin et al., 1995).

Ces expériences ont amené les deux conclusions suivantes :
Deux formes moléculaires sont généralement détectées. Ces deux protéines résultent de la présence de deux sites d'initiation de la transcription. Il a en effet été montré dans un système in vitro qu'une mutation de la Met 1 se traduit par la synthèse d'une seule protéine de 44 kDa (Botto et al., 1997d). Le deuxième site d'initiation, responsable de cette protéine de 44 kDa, n'a pas été identifié.

Les variations de poids moléculaires observées dans les diffèrents types cellulaires (de 47 à 60 kDa) sont certainement le reflet de profils de maturation, et en particulier de glycosylation, distincts.

- Régulation de l'expression de la protéine :
Il semblerait que la neurotensine soit directement impliquée dans la régulation de l'expression du NTR1 par la mise en œuvre de processi variables selon les modèles cellulaires étudiés, mais qui se traduisent in fine par une diminution de la quantité de sites de liaison actifs à la membrane. Ainsi, dans des neurones hypothalamiques, la libération de neurotensine stimulée par la forskoline ou la dexaméthasone se traduit par une diminution des concentrations en NTR1 (Scarceriaux et al., 1996). Un résultat identique est obtenu par apport de NT exogène. Inversement, un antagoniste du NTR1, le SR 48692, inhibe ces effets et induit chez le rat une augmentation de l'expression du récepteur dans certaines aires cérébrales (mésencéphale ventromédian, hypothalamus et cortex piriforme) et dans le côlon (Najimi et al., 1998).

Paradoxalement, cette diminution du nombre de sites s'accompagne d'une activation de la transcription du gène. Dans les cellules HT29 (adénocarcinomes humains) et N1E-115 (neuroblastomes murins) ou dans des cultures primaires de neurones corticaux de rat, la diminution du nombre de sites résulte de la destabilisation de l'ARNm du NTR1 (Lepee-Lorgeoux et al., 2000; Najimi et al., 1998; Souaze et al., 1997). En revanche, dans les cellules CHP212, la diminution apparente du nombre de sites résulte du stockage des récepteurs néosynthétisés dans des vésicules de réserve (Najimi et al., 1998).

Il est difficile, à la vue de ces premières expériences, d'envisager d'établir les mécanismes de cette régulation. Il est en particulier impossible d'affirmer que la liaison de la NT aux récepteurs NTR1 est le facteur prépondérant, puisque ces expériences ne prennent pas en compte l'intervention possible d'autres sous-types de récepteurs de la NT, et en particulier du NTR3 qui est présent dans la plupart des modèles cellulaires étudiés (données non publié).

D'ailleurs in vivo chez l'animal où intervient également le NTR2, les discordances deviennent évidentes. Ainsi en présence de SR 48692, qui est aussi un agoniste du NTR2 (Botto et al., 1997b), on constate une diminution du taux d'expression du NTR1 dans le duodénum et le pancréas et aucune variation dans le striatum (Najimi et al., 1998). De plus des expériences réalisées chez des rats nouveau-nés, où le NTR2 n'est pas encore exprimé, ne montrent aucun effet du SR 48692 sur l'expression du messager du NTR1 (Lepee-Lorgeoux et al., 2000) alors que chez le rat adulte un traitement chronique se traduit par une surexpression notable de ce même messager (Azzi et al., 1996; Yamada et al., 1995).

Nous avons vu dans les chapitres précédents que les voies neurotensinergiques et dopaminergiques semblaient intimement liées puisqu'un traitement à long terme par un antagoniste dopaminergique (l'haloperidol) peut stimuler l'expression du gène de la NT dans le striatum et le noyau accumbens (Dobie et al., 1993; Radke et al., 1998). Ce même type de traitement induit également un accroissement de l'expression du messager codant pour le NTR1 dans la substance noire (Bolden-Watson et al., 1993). Ceci permet de supposer que l'expression de ce messager dans les voies mésencéphaliques est corrélée au fonctionnement des récepteurs D2.

D'autres facteurs pourraient intervenir. Ainsi par exemple dans l'épithélium ciliaire l'expression du NTR1 est stimulée par l'activation des récepteurs b2 adrénergiques (Ortego and Coca-Prados, 1997).


I - B - La protéine NTR1 :

I - B - a - Structure fonctionnelle :
Le NTR1 de rat est une protéine de 424 acides aminés présentant sept domaines hydrophobes putativement transmembranaires qui permettent de le classer dans la famille des RCPG. La séquence protéique comporte quatre sites de N-glycosylation situés dans l'extrémité amino-terminale et dans la 2° boucle extra cellulaire (E2), et deux cystéines dans les boucles extracellulaires E1 et E2 suggérant l'existence d'un pont disulfure. Le récepteur humain est légèrement plus court (418 acides aminés).

Des études par mutagenèse dirigée sur la séquence du messager du NTR1 de rat ont permis de localiser une partie des sites fonctionnels importants de la protéine (Figure 17).

- Sites de liaison de la NT et du SR 48692 :
Plusieurs acides aminés de E2 et E4 sont directement impliqués dans la liaison du peptide au récepteur puisque leur mutation induit une diminution ou même une perte totale d'affinité pour la NT (Botto et al., 1997a; Pang et al., 1996). Le site de reconnaissance du SR48692 recouvre partiellement cette séquence mais est également dépendant d'autres acides aminés de E4 et E3 (Labbé-Jullié et al., 1998; Labbé-Jullié et al., 1995). Ce chevauchement des deux sites de liaison permet de rendre compte des propriétés d'antagoniste du SR48692.

- Site de couplage aux protéines-G :
Des mutants de délétion de la 3° boucle intracellulaire (I3) ont permis de montrer que la région 270-300 était directement impliquée dans le couplage du récepteur aux protéines-Gq activant la phospholipase-C (Yamada et al., 1994).

- Site de sensibilité au sodium :
L'aspartate 113 du 2° domaine transmembranaire (TM2) est directement impliqué dans la sensibilité du NTR1 au sodium. De plus, la mutation de ce résidu diminue notablement la capacité du récepteur d'activer ses seconds messagers ce qui présuppose que l'interaction entre l'aspartate 113 et le Na⁺ est indispensable au maintien du récepteur sous une forme activable (Martin et al., 1999).

- Internalisation du récepteur :
Par mutations successives, deux acides aminés impliqués dans l'internalisation du complexe NT-NTR1 ont été identifiés dans l'extrémité carboxy-terminale de la protéine : il s'agit de la Thr-422 et de la Tyr-424 (Chabry et al., 1995).


I - B - b - Propriétés de liaison du NTR1 :

- Généralités :
Les propriétés de liaison du NTR1 ont d'abord été caractérisées sur homogénat de cerveau de rat. Ces études ont été réalisées avec des dérivés monoiodés de la neurotensine (Mazella et al., 1983; Sadoul et al., 1984b). L'utilisation d'un antagoniste de la liaison de la NT au NTR2, la lévocabastine, a permis de confirmer la présence dans ces tissus des deux types de récepteurs, et d'étudier séparément la composante de haute affinité, le NTR1 (Schotte et al., 1986). Quand au récepteur de type 3, il n'était pas connu à l'époque. Mais nous savons maintenant que son faible taux d'expression à la membrane rend sa contribution à la liaison mesurée négligeable (< 10%) (voir plus loin).

L'affinité de ce récepteur pour la NT est d'environ 0,1 nM. Une affinité identique (de 0,1 à 0,3 nM) a été retrouvée dans le cerveau de souris (Mazella et al., 1988) et de lapin (Vincent et al., 1990) ainsi que dans les neurones en culture primaire (Checler et al., 1986a), et dans un certain nombre de lignées cellulaires telles que les hybrides neuroblastomes-gliomes NG108-15 (Nakagawa et al., 1984; Poustis et al., 1984) et les HT29 (Amar et al., 1986; Kitabgi et al., 1980 ).

Le NTR1 cloné de rat a été exprimé dans divers modèles cellulaires : cellules CHO (Hermans et al., 1992 ; Watson et al., 1992), fibroblastes LTK (Chabry et al., 1994) cellules rénales embryonnaires humaines (HEK 293) (Slusher et al., 1994). Ses propriétés de liaison pour la NT sont peu différentes de celles mises en évidence sur membranes de cerveau. Nous avons signalé plus haut des variations du niveau de glycosylation de la protéine selon le système d'expression, mais ces différences interviennent peu dans les propriétés de liaison du NTR1.

- Pharmacologie :
Des études de relation structure-fonction ont montré l'importance de l'intégrité de la séquence carboxy-terminale 8-13 de la NT pour une reconnaissance optimale de ce peptide par le NTR1 (Kitabgi et al., 1977). Quelle que soit l'espèce étudiée, le peptide 8-13 est toujours le plus affin, et les peptides dont cette séquence est altérée ont toujours une mauvaise affinité. On notera d'ailleurs que ceci est également vrai pour les deux autres récepteurs clonés.

Toutefois, on se rappellera que ces résultats ne rendent pas forcément compte des propriétés pharmacologiques du récepteur in vivo. Nous avons montré dans le chapitre traitant des propriétés pharmacologiques de la NT que certains peptides présentant une très mauvaise affinité pour les récepteurs peuvent avoir une excellente activité pharmacologique dans certains tests. Chez le rat, c'est par exemple le cas de deux peptides entièrement déplétés de leur segment carboxy-terminal (1-8 et 1-10) sur des tests de sécrétion du pancréas exocrine (Nustede et al., 1989; Trimble et al., 1987) et de cytoprotection de l'estomac (Hernandez et al., 1984; Holst Pedersen et al., 1986). C'est également le cas de certains peptides substitués en position 11 avec un acide aminé dextrogyre (D-Trp et D-Tyr) dans des tests d'analgésie. En revanche, le peptide 8-13 qui est dix fois plus affin que le peptide natif ne présente qu'une médiocre activité antinociceptive (al-Rodhan et al., 1991; Jolicoeur et al., 1981b).

On peut envisager que ces observations résultent de la différence de sensibilité de ces peptides aux endo et carboxy-peptidases, ce qui leur assure une demie-vie biologique très différente de celle de la neurotensine native. Cependant, la résistance ou la sensibilité aux peptidases ne suffit pas à expliquer tous les phénomènes observés. Ainsi certains dérivés présentant une très mauvaise affinité pour les récepteurs de la NT (> mM) peuvent être d'excellents antagonistes de certaines propriétés pharmacologiques de la NT. C'est le cas de la D-Trp¹¹-NT qui antagonise très efficacement la diminution de l'activité locomotrice induite par injection centrale de NT mais pas l'hypothermie (Jolicoeur et al., 1981a).

Des expériences récentes ont montré que ces différences d'activité fonctionnelle doivent correspondre à l'activation de sous-populations de récepteurs spécifiques. En effet, selon la région dans laquelle elles sont injectées (région caudale ou rostrale du nucleus accumbens), la D-Tyr¹¹-NT et la NT 8-13 sont respectivement plus efficaces ou au contraire moins efficaces que la NT pour induire la libération de dopamine dans le cortex préfrontal (Sotty et al., 2000).

Deux hypothèses sont envisageables. La première est que ces peptides activent spécifiquement des sous-types de récepteurs non encore identifiés (puisque tous les récepteurs identifiés ont une très mauvaise affinité pour les peptides substitués par un acide aminé dextrogyre en position 11). Pour notre part, nous avons tenté de localiser de tels récepteurs par liaison de la ¹²⁵I-DTrp¹¹-NT sur coupes de cerveau de rat et de souris. Nous n'avons pu constater qu'une absence totale de liaison spécifique (données personnelles non publiées).

La deuxième hypothèse est l'existence d'une sous-population de récepteurs se présentant in vivo sous un état d'activation particulier, susceptible d'être reconnu par un agoniste spécifique. Nous avons présenté dans l'introduction sur les RCPG un modèle simplifié où le récepteur pouvait être soit dans un état actif, soit dans un état inactif. En fait de nombreux arguments pharmacologiques permettent maintenant de penser qu'entre l'état actif et l'état inactif, il existe de nombreux états intermédiaires qui seront "préférés" par un agoniste (ou un antagoniste) donné (Kenakin, 1995a; Kenakin, 1995b; Kenakin, 1997; Tucek, 1997). Cet aspect est d'ailleurs abordé plus loin, dans le chapitre traitant de la e1BH-Lys²-NN .
Plusieurs molécules ont été développées dans le but d'étudier les propriétés fonctionnelles des récepteurs de la neurotensine.

Les laboratoires Sanofi ont développé deux antagonistes non peptidiques de la NT, le SR48692 et le SR142948A. Ces molécules très lipophiles traversent aisément toutes les membranes cellulaires et peuvent donc être utilisées par administration périphérique (voie orale, intraveineuse ou intrapéritonéale) pour étudier les propriétés pharmacologiques centrales de la NT.

Les résultats les plus originaux ont été obtenus avec le SR48692 et tiennent au fait que cette molécule se lie à la fois au NTR1 comme antagoniste et au NTR2 comme agoniste. Cette particularité a permis de définir quels récepteurs étaient responsables de certains effets centraux de la NT. Ainsi, le SR48692 inhibe deux types de comportements induits par la neurotensine : les mouvements rotatoires après injection intra-striatale de NT (Gully et al., 1993) ainsi que l'hypomotilité (Dubuc et al., 1994). Ces deux propriétés sont donc attribuables au NTR1. En revanche le SR48692 est incapable d'inhiber les propriétés hypothermiantes et analgésiantes de la NT (Dubuc et al., 1994). Par la suite, des injections chroniques d'oligonucléotides anti-sens spécifiques du NTR2 de rat ont permis de montrer que l'analgésie est dépendante du NTR2 (Dubuc et al., 1999b) (voir chapitre suivant sur le NTR2). Quand à l'hypothermie, aucun récepteur ne lui est pour le moment attribuée.

- Le NTR1 dans le cerveau humain (Zsürger et al., 1992) :
Peu de données existaient sur le récepteur humain, en particulier du fait des concentrations extrêmement faibles dans le cerveau adulte (Sadoul et al., 1984b). Dans le cadre d'un programme d'étude sur la mort subite du nourrisson, nous avons réalisé la caractérisation biochimique du NTR1 dans le cerveau de nouveau-né humain, ces tissus représentant une source beaucoup plus riche en récepteurs que le cerveau adulte (voir plus loin, ontogenèse du récepteur).

La mort subite inexpliquée du nourrisson (MSIN) est définie comme "le décès soudain d'un jeune enfant, inattendu de par son histoire, et qui demeure inexpliqué malgré les examens réalisés après la mort" (Kahn et al., 1988). Elle survient durant le sommeil, le plus souvent la nuit, chez des nourrissons âgés de 1 à 3 mois. Bien que l'étiologie semble multifactorielle, le mécanisme final est toujours une apnée fatale. En effet, des études cliniques ont montré une augmentation de la durée et du nombre des apnées pendant le sommeil chez des nourrissons ultérieurement décédés (Kahn et al., 1988) ou rescapés (Duffty and Bryan, 1982) d'une MSIN.

Les seules anomalies anatomiques ou biochimiques du système nerveux central actuellement décrites correspondent à un défaut de maturation des zones du tronc cérébral assurant un contrôle végétatif (Kinney et al., 1992; Kopp et al., 1992; Quattrochi et al., 1985). L'ensemble des ces données bibliographiques nous a permis de considérer que les cortex provenant de sujets décédés de MSIN n'étaient pas différents des cerveaux témoins et pouvaient donc être utilisés pour caractériser les récepteurs de la neurotensine chez l'homme.

Nous avons montré au cours de cette étude que dans le cerveau humain, le NTR1 a une affinité de 0,3 nM pour la NT avec une cinétique d'association à 20°C très rapide (90 % de la liaison maximale est réalisée en deux minutes). La liaison est sensible au GDP, au GTP et au GTPgS. Comme cela a déjà été décrit pour d'autres espèces, le peptide 8-13 est nettement plus affin que la NT (IC50 = 0,08 nM) ; en revanche, la Trp¹¹-NT et la NN sont dix fois moins bien reconnues que la NT, et la DTrp¹¹-NT est très mal reconnue (IC50 = 1,5 10-7 M). La liaison est sensible aux ions Na⁺, Ca2+, Mg2+ et Li+ (IC50 = 25 mM) et moins sensible au potassium (IC50 = 150 mM). Nous verrons plus loin que cette faible sensibilité au potassium a été utilisée pour améliorer le rendement de purification du NTR3 par chromatographie d'affinité.

La liaison covalente de la ¹²⁵I-Tyr³-NT par un agent réticulant (disuccinimidyl subérate) sur homogénat de cerveau humain nouveau-né a permis de mettre en évidence l'existence de plusieurs protéines liant spécifiquement la NT : le NTR1 à 50 kDa, le NTR3 à 100 kDa et une protéine non identifiée à 35 kDa (Figure 18).


I - C - Systèmes de transduction du NTR1 :

- Dans les cellules :
La liaison de la NT au NTR1 induit la stimulation de la phospholipase C. Cette activation a pour conséquence la production d'inositol triphosphate (IP3) et de diacylglycérol à partir de phospholipides membranaires (PiP2). IP3 provoque alors la mobilisation du calcium intra-cellulaire (Figure 19). Cette suite d'événements a été détaillée dans la lignée HT29 (Amar et al., 1986; Bozou et al., 1989b; Turner et al., 1990), dans les neuroblastomes N1E-115 (Amar et al., 1987), dans les neurones en culture d'hémisphères cérébraux (Sato et al., 1991; Weiss et al., 1988) et de glande pituitaire (Canonico et al., 1985a) mais également pour le récepteur cloné exprimé dans les CHO (Hermans et al., 1992 ; Watson et al., 1992), les fibroblastes LTK (Chabry et al., 1994) ou des cellules rénales embryonnaires humaines (HEK 293) (Slusher et al., 1994).

Dans ces modèles cellulaires, l'activation des seconds messagers par la neurotensine est antagonisée par le SR 48692 (Oury-Donat et al., 1995).

Selon l'équipement enzymatique de la cellule, l'élévation du calcium intracellulaire se traduit par une deuxième séquence d'événements comme par exemple, dans les neuroblastomes N1E115, l'activation de la guanylate cyclase et la production de GMP cyclique (Amar et al., 1985). Le calcium mobilisé précédemment se lie à la calmoduline et stimule la NO synthétase qui génère de l'oxyde nitrique (NO). Ce composé active à son tour la guanylate cyclase cytosolique responsable de la formation de GMP cyclique (Figure 19), (Marsault and Frelin, 1992). Ce mécanisme est inhibé par un antagoniste de la NO synthétase (McKinney et al., 1990).

Le rôle clé du NO dans ce mécanisme a été vérifié sur les cellules HEK 293 qui n'expriment pas naturellement de NO synthétase et dans lesquelles la neurotensine n'induit pas l'activation de la guanylate cyclase. En revanche, si la NO synthétase est coexprimée dans ces cellules, la NT induit la formation secondaire de GMP cyclique (Slusher et al., 1994).

Dans la mesure où ce gaz est extrêmement diffusible, il doit être possible, in vivo, que des cellules proches soient activées par NO et donc répondent de façon indirecte à un signal neurotensinergique, sans posséder elles-mêmes de récepteurs de la neurotensine. Cette hypothèse a été vérifiée dans des cocultures de neuroblastomes et de cellules endothéliales : les cellules endothéliales sont dépourvues de récepteurs de la neurotensine, mais répondent de façon indirecte à la neurotensine par la production de GMP cyclique (Marsault and Frelin, 1992).

L'action de la neurotensine sur l'adénylate cyclase est plus controversée. Ainsi, dans des neuroblastomes différenciés par déplétion de sérum et ajout de DMSO, il a été décrit une inhibition de la production d'AMP cyclique. Cet effet semble résulter de l'activation de deux voies, l'élévation du calcium intra-cellulaire et le couplage à une protéine-G sensible à la toxine pertussique (Gi) (Bozou et al., 1986; Bozou et al., 1989a). En revanche, d'autres auteurs décrivent dans les mêmes cellules une stimulation de la production d'AMP cyclique (Gilbert et al., 1986). Ces résultats contradictoires pourraient résulter de l'utilisation de cellules se présentant sous différents états de différenciation et donc exprimant des niveaux de Gs et Gi différents.

Dans les cellules CHO transfectées avec le NTR1 on observe également une stimulation de l'adénylate cyclase, indépendante du calcium, et passant par l'activation d'une protéine-Gi/o (Yamada et al., 1993). D'autre part, dans les mêmes cellules, la NT induit l'activation d'une voie de transduction sensible à la toxine pertussique, c'est à dire passant par une protéine Gi/o et la production d'acide arachidonique (Gailly et al., 2000). On sait que l'acide arachidonique peut être produit par deux voies. La première est directe et résulte de l'activation par une protéine-G de la phospholipase A2 qui agit sur les phospholipides membranaires ; la deuxième est secondaire à la production de diacylglycérol et résulte de l'action d'une diglycéride-lipase. Dans ces cellules, les deux processus sont actifs puisque l'inhibition de la production d'acide arachidonique induite par la NT n'est inhibée que par le bloquage simultané des deux voies. Un mécanisme identique a été mis en évidence dans les cellules pituitaires en culture (Canonico et al., 1985b).

La neurotensine induit donc dans ces cellules l'activation simultanée de plusieurs voies de transduction qui sont susceptibles de rétroagir les unes sur les autres. Par exemple, l'acide arachidonique, à son tour, via la production de prostaglandines et de thromboxanes, peut stimuler la phospholipase C, l'adénylate cyclase et la guanylate cyclase et libérer le calcium intracellulaire. Il sera donc très difficile d'extrapoler les résultats obtenus sur des cultures cellulaires pour comprendre les mécanismes qui régissent les modes d'action de la neurotensine dans un tissu composé de cellules différentes

- Dans le système nerveux central (Gaudriault et al., 1996) :
Aussi bien in vivo que in vitro, les mesures du niveau de couplage d'un récepteur dans un tissus sont rendues très difficiles par l'hétérogénéité des populations cellulaires et donc la dispersion et la multiplicité des signaux. Il serait donc avantageux de posséder des ligands reconnaissant spécifiquement un sous-groupe de récepteurs présent à un moment donné dans un état d'activation ou d'inactivation particulier.
Au cours de nos recherches sur les récepteurs de la neuromédine N (NN) (voir plus loin) nous avons sélectionné un dérivé de la neuromédine N qui reconnaît spécifiquement une sous-population de sites de liaison très sensibles au GTP. Ce réactif a été obtenu par acylation sélective avec le groupement de Bolton-Hunter de la Lys²-NN. La méthode permettant de discriminer entre les réactifs marqués en position a ou e repose sur une sélection précise du pH et une séparation par HPLC (Gaudriault and Vincent, 1992). Des dérivés radiomarqués peuvent ainsi être réalisés par fixation du ¹²⁵I-Bolton-Hunter ou du N-succinimidyl [2,3-³H]-propionate sur l'amine terminale (a1BH-Lys²-NN) ou sur les amines latérales des deux lysines (e1BH-Lys²-NN et e2BH-Lys²-NN) (Tableau 5).

Les expériences réalisées sur homogénat de cerveau montrent que les dérivés marqués en a se comportent exactement comme la NT, alors que les réactifs marqués en e ne reconnaissent qu'une partie des sites de liaison de la neurotensine.

Cette liaison est très sensible au GTP puisque en présence de 10-5 M GTPgs, le signal est inhibé (Figure 20). Cette spécificité de liaison pour une sous-population de récepteurs couplés aux protéines-G a été confirmée par des études réalisées sur le NTR1 transfecté dans diverses lignées cellulaires. Dans les cellules COS, où le niveau de couplage est bas, la liaison est pratiquement inexistante, alors que dans les cellules AA1 où le récepteur active efficacement la phospholipase C, la liaison de la e1BH-Lys²-NN est égale à la moitié de la liaison totale de la NT.

En fait des expériences de saturation ont montré que les récepteurs découplés des protéines G étaient reconnus avec une très mauvaise affinité (Figure 20). Une cartographie détaillée des sites reconnaissant spécifiquement la e1BH-Lys²-NN a été réalisée en parallèle avec la cartographie des sites liant la NT, sur coupes de cerveau de souris adulte. Les conditions ont été mises au point de façon que la liaison imputable au NTR2 soit négligeable. Nous avons pu montrer une hétérogénéité importante dans la répartition de ces deux populations de récepteurs. Dans la majorité des zones, les sites e1BH-Lys²-NN ne représentent qu'un tiers des sites totaux. C'est le cas en particulier de la formation hippocampale, du noyau ventro-médian de l'hypothalamus, de la substance noire réticulée ou de la bande de Brocca. En revanche, dans certaines zones, les sites e1BH-Lys²-NN représentent l'essentiel de la population des récepteurs. C'est le cas en particulier dans les cortex entorhinal et endopiriforme, dans le noyau postéromédian de l'amygdale et dans les noyaux centraux et genouillés du thalamus (Figure 21). Enfin, certaines zones sont très pauvres en sites e1BH-K2NN, en particulier les noyaux du raphé.

Ces expériences sur coupes de cerveau de souris ont permis de confirmer la très grande sensibilité des sites e1BH-Lys²-NN au GTP. Il semble donc que ce ligand soit un outil tout à fait nouveau pour l'étude de la NT, permettant de dissocier la notion de capacité fixatrice maximale de la notion de nombre de sites fonctionnels. La NT pourrait se lier à tous les récepteurs présents y compris des sites non ou peu couplés (récepteurs de réserve, récepteurs désensibilisés par phosphorylation ou palmitoylation) ; en revanche, la e1BH-Lys²-NN ne reconnaîtrait avec une bonne affinité qu'une fraction des récepteurs de la NT sensibles au GTP, c'est-à-dire couplés à une protéine-G.

La notion qu'un ligand puisse reconnaître spécifiquement un récepteur dans une état particulier d'activation est relativement récente, mais semble être de mieux en mieux argumentée. Ainsi, la bremazocine et l'étorphine reconnaissent des populations de récepteurs opiacés différents. La bremazocine reconnaît deux fois plus de sites que l'étorphine et la liaison est très peu sensible au GTP. Cependant la liaison de la bremazocine est entièrement déplacée par l'étorphine. On en déduit donc que ces deux ligands reconnaissent un même récepteur, mais avec des affinités différentes selon l'état de couplage à des protéines-G (Richardson et al., 1992).

La e1BH-Lys²-NN devrait donc aider à faire progresser la compréhension des mécanismes fonctionnels du NTR1.


I - D - Internalisation du complexe NT- NTR1 :

Les RCPG ont d'abord été confinés à une fonction de catalyseur de l'échange GDP-GTP dans la protéine Ga c'est-à-dire la première étape de la transduction intracellulaire du signal peptidergique par une protéine-G. On sait maintenant que l'activation du récepteur par son agoniste se traduit par une deuxième étape aussi importante, l'internalisation du complexe ligand-récepteur. Nous avons vu dans l'introduction que ce mécanisme est crucial pour le fonctionnement de la cellule. Tout d'abord, il est largement impliqué dans les phénomènes de désensibilisation-resensibilisation. Et d'autre part, il permet une nouvelle transduction du message, totalement différente de celle opérant à la membrane. Dans le cerveau, ce mécanisme (sommairement décrit dans l'introduction sur les mécanismes moléculaires de la neurotransmission), est la première étape permettant le transport rétrograde du peptide dans la cellule post-synaptique. Mais ce mécanisme est également présent dans des cellules non neuronales.

Ce mode de fonctionnement à deux niveaux n'est du reste pas spécifique des RCPG puisque l'activation des facteurs de croissance est totalement dépendante de l'internalisation : l'activation des kinases est inhibée si l'internalisation est bloquée.

Dans le cas de la neurotensine, l'internalisation du complexe ligand-récepteur a été mise en évidence dans les neuroblastomes N1E-115 (Donato di Paola et al., 1993), dans les cellules HT29 (Turner et al., 1990), dans les neurones en cultures primaires (Mazella et al., 1991; Vanisberg et al., 1991) et dans les cellules SN17 (hybride neurone-neuroblastome) (Faure et al., 1995b). Ce mécanisme a également été étudié sur le NTR1 de rat exprimé dans des fibroblastes (Chabry et al., 1994), dans des cellules CHO (Hermans et al., 1994), dans des cellules COS-7 (Vandenbulcke et al., 2000) et dans des cellules SF9 (Faure et al., 1995a).


- Internalisation du complexe NTR1-NT :
L'endocytose du complexe ligand-récepteur est fonction de la température et du temps (Mazella et al., 1991; Turner et al., 1990; Vanisberg et al., 1991). L'internalisation est inhibée à 0°C, c'est-à-dire qu'elle dépend de la fluidité membranaire. Elles est également inhibée par l'oxyde de phénylarsine (PAO) ou par une concentration élevée en sucrose, connue pour bloquer l'endocytose intervenant au niveau des puits tapissés de clathrine.

Une étude par microscopie confocale sur des cellules COS-7 transfectées avec le NTR1 a permis de suivre la cinétique d'internalisation et le devenir du NTR1 et de la NT (Figure 22, Vandenbulcke et al., 2000). Dans les cinq premières minutes, la NT est associée au récepteur membranaire. Le complexe ligand-récepteur est ensuite internalisé et retrouvé dans un compartiment endosomial précoce. Après 30 minutes, le ligand et le récepteur se retrouvent dans des compartiments séparés. Le peptide est transféré dans les endosomes tardifs puis à proximité du noyau, dans le transgolgi, où une fraction est retrouvée intacte. Le récepteur, quant à lui, est transféré dans les lysosomes et dégradé.

Deux points remarquables sont à noter : le parcours du NTR1 et de la NT dans des compartiments séparés, et la durée de vie du peptide dans la cellule (plus de 45 minutes) malgré les activités peptidasiques présentes. Nous allons voir qu'un processus similaire intervient probablement au cours du transport rétrograde.


- Internalisation et désensibilisation :
L'application de neurotensine sur des cellules se traduit par une diminution rapide du nombre de sites de liaison à la surface. Dans les cellules HT29, l'effet intervient rapidement, mais n'atteint sa valeur maximale qu'au bout de 45 minutes (Turner et al., 1990). Dans les neuroblas-tomes, le mécanisme semble nettement plus rapide, avec un effet maximum au bout de 15 minutes. Dans tous les cas, la préincubation des cellules avec le peptide froid se traduit par une régulation négative de la cellule, visualisée non seulement par la diminution du nombre de sites accessibles, mais aussi par la diminution de la mobilisation du calcium intracellulaire et de la production d'IP3.

Lorsque la préincubation avec le ligand est longue, la récupération est également longue. Ainsi dans les neuroblastomes, après 12 heures de préincubation, le temps de demi-récupération est de 4 heures (Donato di Paola et al., 1993).

Les processus mis en œuvre au cours de la désensibilisation varient selon le type cellulaire. Dans les neurones en culture, la diminution du nombre de sites NTR1 après 24 heures d'incubation avec la NT n'est pas liée à une diminution des ARNm et peut être atténuée par bloquage du trafic lysosomial (par la chloroquine et la méthylamine) (Hermans et al., 1997). Il y a donc bien là mise en place d'un processus de régulation négative par activation de la dégradation des récepteurs dans les lysosomes. Du reste, la resensibilisation peut-être ralentie par un inhibiteur de la synthèse protéique (cycloheximide) ce qui prouve que le retour des récepteurs à la membrane ne résulte pas d'un recyclage, mais d'une synthèse de novo.

Dans les cellules HT29, la réponse varie en fonction du temps de contact avec la neurotensine. Pour des temps relativement courts (6 heures), on observe une augmentation très importante des ARNm du NTR1 qui correspond à une activation de la synthèse d'un nouveau pool de récepteurs. En revanche, pour des temps beaucoup plus longs (24 heures) les ARNm sont fortement diminués par racourcissement de leur demi-vie (Souaze et al., 1997).


- Internalisation et NTR3 :
Dans les cultures primaires de neurones de souris, il a été montré que les mécanismes d'internalisation interviennent dans le recrutement d'une nouvelle population de sites récepteurs. En effet lorsque ces mécanismes ne sont pas bloqués, la capacité fixatrice est nettement augmentée par rapport à la capacité fixatrice observée à 0°C ou en présence de PAO. Il a été montré que ceci ne résulte pas d'un phénomène de recyclage mais de l'apparition d'un nouveau pool de récepteurs à la membrane : ces expériences ont permis de mettre en évidence l'existence d'une nouvelle classe de récepteur de la neurotensine, le NTR3 (Figure 23) (Chabry et al., 1993).

Dans la cellule non stimulée par la NT, cette protéine de 100 kDa est essentiellement présente (au moins 90 %) dans un compartiment vésiculaire. Le bloquage des processus d'internalisation du NTR1 empêche également son exocytose. On ne sait pas actuellement si l'internalisation préalable du NTR1 intervient directement dans le processus de recrutement du NTR3 ou si ce mécanisme ne dépend que de l'activation de la petite population de NTR3 déjà présente à la membrane.

Un processus similaire pourrait intervenir dans les cellules HT29. Lorsque ces cellules sont soumises à une préincubation de courte durée avec la NT (5 à 15 min) la récupération de la capacité fixatrice intervient très rapidement (15 à 20 min). Mais cette récupération ne s'accompagne pas d'une resensibilisation, c'est-à-dire d'une récupération fonctionnelle de l'activation des seconds messagers (Turner et al., 1990). Il ne s'agit pas là de recyclage et du reste, il a été montré que le NTR1 est insensible à la monensine, c'est à dire non recyclé (Botto et al.1998; Chabry et al., 1993). Les récepteurs exprimés dans ces conditions constituent donc une population différente de récepteurs, proba-blement identiques au NTR3 mis en évidence sur cultures de neurones.

- Internalisation et transport rétrograde :
Après son internalisation, le complexe ligand-récepteur peut être transporté de façon rétrograde dans le système nerveux central. Ce mécanisme a été particulièrement étudié sur la voie nigro-striée dopaminergique.

Ainsi, 4h après injection de neurotensine radiomarquée dans le striatum de rat, la radioac- tivité est retrouvée dans la substance noire et le VTA (Castel et al., 1990). Cette apparition est spécifiquement dépendante de la liaison au récepteur. Cette cinétique correspond à celle du transport axonal rapide (1-5 mm/h). Et du reste, l'apparition de la radioactivité dans la substance noire dépend bien de l'activité des microtubules puisque elle est inhibée par la colchicine. Une partie relativement importante du peptide (25 %) est retrouvée intacte et non dégradée dans la substance noire (Castel et al., 1991).

Des études par microscopie électronique ont permis de montrer qu'une fraction de la radioactivité est présente dans les axones et dendrites, mais que l'essentiel (85 %) est retrouvé dans le corps cellulaire au niveau du réticulum endoplasmique rugueux, du Golgi et du noyau (Castel et al., 1992).

Une étude par microscopie confocale, sur coupes semi-fines perfusées de cerveau de rat au niveau du mésencéphale, a permis de confirmer le transport rétrograde de la NT dans les neurones dopaminergiques depuis les extrémités axonales et dendritiques jusqu'au noyau de la cellule dans la substance noire et l'aire ventrotegmentaire (Faure et al., 1995c).

Ces observations permettent de penser que la NT pourrait intervenir dans le contrôle de l'expression génique, et assurer la délivrance d'un message à long terme.


I - E - Localisation du récepteur :

Tout comme la neurotensine, le NTR1 se retrouve chez l'adulte distribué à la fois dans le système nerveux central et en périphérie.

I - E - a - Localisation dans le système nerveux central :

- Système nerveux central de rat :
La majorité des études réalisées sur les récepteurs de la neurotensine ont été faites chez le rat. Dans le système nerveux central, le NTR1 semble localisé exclusivement dans les neurones et n'a pas été détecté dans les cellules gliales. Une étude par liaison de ¹²⁵I-Tyr³NT sur coupe de cerveau de rat et examen par microscopie électronique a permis de montrer que les sites de liaisons de haute affinité étaient situés essentiellement dans le corps cellulaire (80 à 89 %) et qu'une partie non négligeable était située sur le noyau (20 %). Les récepteurs membranaires sont répartis de façon diffuse, et non pas concentrés dans des zones de jonctions avec des axones, ce qui confirme le mode de transmission paracrine du peptide (Szigethy et al., 1990). Toutefois, ce ligand ne permet pas de discriminer entre NTR1 et NTR3 et il donc impossible de savoir qu'elle est la répartition respective des deux récepteurs.

La localisation régionale du récepteur a été largement explorée par les techniques de liaison sur coupe ou sur homogénats d'échantillons cérébraux. Nous avons déjà signalé dans le chapitre sur les propriétés de liaison du NTR1 qu'on peut estimer, lorsque les expériences sont réalisées à faible concentration de ligand iodé (0,1 nM), que la liaison mesurée est essentiellement imputable au site NTR1. En revanche, les premiers travaux réalisés sur le cerveau de rat avec des concentrations élevées de ligand tritié (4 nM) ne pouvaient pas discriminer entre le NTR1 et le NTR2. On gardera donc en mémoire que les cartographies cérébrales très détaillées réalisées par ces auteurs représentent indistinctement l'ensemble des sites de liaison NTR1 et NTR2.

Les premières localisations effectuées chez le rat ont montré la présence de sites de liaison de la NT dans les bulbes olfactifs, le cortex pré-frontal, cingulaire et périrhinal, le septum latéral, les tubercules olfactifs, la bande latérale de Brocca et le lit de la strie terminale, le striatum, l'habenulla médiane, les corps mammillaires, la substance noire compacte et l'aire ventro-tegmentale, le pons, le plancher du IV° ventricule, le raphé magnus, le noyau du tractus solitaire et la substance gélatineuse (Quirion et al., 1982b; Young and Kuhar, 1981).

Une étude ultérieure réalisée en présence de lévocabastine, un composé qui reconnait spécifiquement les récepteurs NTR2, a permis d'affiner ces résultats, en montrant en particulier qu'une partie des sites de liaison visualisés dans le cortex, l'hippocampe, le thalamus et les tubercules quadrijumeaux antérieurs sont en fait des récepteurs de type 2 (Figure 24) (Kitabgi et al., 1987).

Aussi bien dans les espèces murines que chez l'homme, on constate une faible corrélation entre les localisations du peptide et de ses récepteurs. En particulier, peu de sites de liaison sont détectés dans l'hypothalamus et la medulla dont certains noyaux présentent des taux de neurotensine élevés.

Les récepteurs NTR1 ont également été localisés par immunohistochimie sur le cerveau de rat grâce à un anticorps dirigé contre la 3° boucle intracellulaire du récepteur (Boudin et al., 1996). La localisation des récepteurs ainsi détectés est souvent semblable à celle décrite par les expériences de liaison ligand-récepteur, en particulier dans la bande de Brocca, la substance noire, l'aire tegmentaire ventrale, le subiculum ou le pons. En revanche, certaines aires riches en sites de liaison ne sont pas immunoréactives, en particulier le noyau de l'amygdale, l'aire périaque-ductale grise, la couche externe des tubercules quadrijumeaux antérieurs et le noyau dorsal du tegmentum. Il pourrait donc y avoir dans le cerveau un autre site de haute affinité ou plusieurs isoformes du NTR1.

Ainsi, les auteurs ont montré que chez le rat juvénile, cet anticorps détecte dans le cerveau deux protéines différemment glycosylées sur leur segment amino-terminal. La forme de plus faible poids moléculaire et donc la moins glycosylée, n'est plus retrouvée chez l'adulte et correspond donc à un processus de maturation spécifique du nouveau-né (Boudin et al., 2000).

Par hybridation in situ, le messager du NTR1 est retrouvé dans le cerveau de rat au niveau de la bande diagonale de Brocca, du septum médian, des noyaux supra-chiasmatique et supra-mammilaire, de la substance noire compacte et de l'aire tegmentaire ventrale, de l'hypothalamus, du thalamus ventral et de la formation réticulaire médullaire (Alexander and Leeman, 1998; Elde et al., 1990; Nicot et al., 1994).

On constate que le messager du NTR1 n'est pas retrouvé dans toutes les zones où la protéine a été détectée. C'est le cas en particulier dans le striatum où une activité de liaison importante est rapportée par tous les auteurs. Il est probable que le récepteur, après sa synthèse dans les corps cellulaires, est transporté dans des vésicules jusqu'aux extrémités dendritiques et/ou axonales. Ainsi, une lésion de la substance noire induit une perte de 30% des récepteurs de la NT dans le striatum, ce qui prouve qu'une partie des récepteurs NTR1 de cette région sont d'abord synthétisés dans les corps des neurones nigro-striés, puis transportés dans les projections striatales ; de même une lésion du cortex préfrontal induit une perte de 20 % des récepteurs de la NT dans le striatum (Goedert et al., 1984b).

- Système nerveux central humain :
Les cartographies réalisées chez l'homme (Kanba et al., 1986; Sarrieau et al., 1985) ont montré des résultats assez semblables à ceux du rat : les récepteurs de la neurotensine sont présents essentiellement dans la substance noire compacte et l'aire tegmentaire ventrale, dans les noyaux de l'amygdale, dans le striatum (noyau caudé et nucleus acumbens), dans les cortex cingulaire, enthorrhinal et olfactif (Figure 25).

Dans la moelle épinière, les récepteurs sont répartis dans la substance grise de façon uniforme, de la région cervicale à la région coccygienne. Les concentrations les plus élevées sont retrouvées dans la couche II de la corne dorsale (Faull et al., 1989).

- Système nerveux central de souris (données personnelles non publiées) :
Très peu de données existaient sur la localisation des récepteurs de la neurotensine chez la souris, l'essentiel des données de la bibliographie portant sur le rat. Dans le cadre d'un projet plus vaste qui devait nous amener à utiliser des souris transgéniques, nous avons donc entrepris de réaliser une étude détaillée chez cet animal.

Les cartographies que nous avons réalisées sur le cerveau montrent des taux de récepteur beaucoup plus élevés que chez le rat, ce qui est en concordance avec les données obtenues sur homogénat de cerveau (Mazella et al., 1988).

On notera en particulier que les taux sont extrêmement élevés dans l'ensemble du cortex, avec des valeurs qui oscillent autour de 50 fmol/mg de protéines, soit 5 à 10 fois plus que chez le rat. Les couches profondes du cortex sont nettement plus marquées que les couches superficielles (Figure 26).

Certains noyaux thalamiques comme les noyaux antéro-latéral, centro-latéral, ventro-médian et prétectal antérieur sont très fortement marqués alors qu'ils ne le sont pas du tout chez le rat.

La formation hippocampale dans son ensemble, sauf le CA3, est fortement marquée ce qui n'est pas le cas chez le rat où les valeurs mesurées sont plus faibles (résultats non montrés).


En conclusion, nous avons montré que presque toutes les aires riches en récepteurs chez le rat le sont également chez la souris, en particulier sur la voie méso-cortico-limbique. Seule l'habenula médiane qui présente une grande quantité de récepteurs chez le rat n'est pas du tout marquée chez la souris.

En revanche, nous avons mis en évidence des différences d'intensité de marquage importantes au niveau cortical et hippocampal, et des marquages spécifiques au niveau thalamique et spinal qui permettent de penser que la NT exerce chez la souris une activité fonctionnelle originale qu'il serait intéressant d'explorer.

On notera en particulier l'importance des marquages dans des noyaux thalamiques qui envoient des afférences en direction du cortex moteur et constituent un relai diencéphalique important des voies motrice extra pyramidale (noyau antéro ventral) et des voies hypothalamo corticales (noyau ventro médian) (Laget, 1973).

De même, on notera que dans la moelle épinière, nous avons mis en évidence une localisation préférentielle au niveau de la corne ventrale, qui assure la motricité des mucles squelettiques (Figure 26c) alors que chez le rat et l'homme les récepteurs de la neurotensine sont concentrés dans la corne dorsale sensitive.Chez la souris, la neurotensine pourrait donc intervenir davantage que chez d'autres espèces dans la régulation de la motricité.

I- E - b - L'œil (données personnelles non publiées) :

Nous avons vu dans les chapitres précédents que de nombreuses données de la bibliographie mettent en évidence la présence de NT dans la rétine. En revanche, peu de données sont encore accessibles sur la présence de récep- teurs dans ce tissu et sur leur fonctionnalité.
Une étude par liaison de ³H-NT sur membranes de rétines de poussin montre l'existence d'un site de basse affinité (3,4 nM) et de capacité fixatrice étonnement élevée (115 pmol/mg) (Osborne, 1986). De façon très surprenante, les auteurs n'ont pas mis en évidence la présence de ces récepteurs sur coupe de rétine. Nous avons donc décidé d'étudier les récepteurs de la neurotensine dans la rétine de différentes espèces mammifères, et en particulier de souris.

Des expériences de fixation de la ¹²⁵I-Tyr³-NT (25 pM) sur coupes de rétines de souris ont mis en évidence l'existence de récepteurs de haute affinité (Figure 27). Les récepteurs sont concentrés essentiellement dans la couche nucléaire interne, c'est-à-dire la couche rétinienne qui renferme les corps des cellules amacrines (qui synthétisent et libérent la neurotensine) mais également des cellules horizontales et des cellules bipolaires (Figure 10). Des expériences similaires réalisées chez le rat ont montré une localisation identique avec une intensité de marquage beaucoup plus faible (résultats personnels non montrés).

Cette localisation semble fonctionnellement importante car de nombreux éléments, aussi bien au niveau de l'œil qu'au niveau cérébral, nous permettent de penser que la neurotensine pourrait intervenir à différents niveaux des processus visuels.

Au niveau de l'œil, le peptide et son récepteur se retrouvent dans la même couche de la rétine, la couche nucléaire interne. Il semble bien que cette colocalisation soit parfaitement fonctionnelle puisque nous avons montré dans les chapitres précédents que la NT est capable d'induire un certain nombre de réponses dans la rétine. Nous rappellerons en particulier que les rétines de poussin répondent à une application de NT par une stimulation de la production d'AMPc (Firth and al., 1998) et des variations oscillantes du calcium cytoplasmique, variations qui sont inhibées par un antagoniste de la phospholipase C (Borges et al., 1996). Les récepteurs de la neurotensine présents dans la couche nucléaire interne de la rétine semblent donc couplés à des systèmes de transduction protéine-G/ phospho-lipase-C et protéine-G/adénylate cyclase, comme cela a déjà été vu dans les différents types cellulaires étudiés.

D'autre part, nous avons vu dans l'introduction que la libération de la NT semble obéir à un rythme lumière-obscurité opposé à celui de la dopamine. Plusieurs expériences montrent qu'il pourrait exister dans la rétine une interaction fonctionnelle entre les deux systèmes de transmission. On notera en particulier que sur rétine de rat et de poussin, la neurotensine facilite ou induit la libération de dopamine (Bauer et al., 1985; Ogura et al., 1989).

Enfin au niveau central, on peut noter que chez la souris, les noyaux thalamiques du tractus visuel, c'est-à-dire les noyaux géniculés latéraux directement impliqués dans le traitement du signal visuel, ainsi que l'aire prétectale qui coordonne le réflexe pupillaire, sont des zones riches en récepteurs de la NT (Figure 26). Des expériences préliminaires entrepris dans notre laboratoire pour mesurer la réactivité électrique de la rétine en présence de NT ont montré une réponse inhibitrice rapide, forte et persistante. Ces travaux sont actuellement poursuivis pour tenter d'appréhender le rôle fonctionnel de la NT dans les mécanismes visuels.

I - E - c - Localisation du NTR1 en périphérie :

- Présentation :
Alors que l'essentiel du peptide est retrouvé dans le tube digestif, les récepteurs de la neurotensine n'y sont présents qu'à des concentrations relativement faibles.

Dans l'intestin, la présence de récepteurs a d'abord été mise en évidence indirectement par l'intermédiaire des réponses contractiles (Carraway and Leeman, 1973; Kitabgi and Freychet, 1978; Kitabgi and Vincent, 1981) et électrophysiologiques (Kitabgi et al., 1979) induites par le peptide sur des portions d'organe isolé. Des études de liaisons de neurotensine radiomarquée sur coupes de tissus ou sur préparations membranaires ont ensuite permis de confirmer ces résultats.

Chez le porc, les récepteurs de la NT sont présents en particulier dans la partie distale du jéjunum, au niveau de la muqueuse et de la sous-muqueuse ainsi que du plexus myentérique ; peu de récepteurs sont observés au niveau du muscle circulaire (Seybold et al., 1990). Chez le chien, des membranes plasmiques préparées à partir de muscle circulaire contiennent deux types de récepteurs de la NT, un de haute affinité (0,1 nM) et un de basse affinité (3 nM) (Ahmad et al., 1987). Les récepteurs sont également présents dans les couches musculaire profonde et sous muqueuse, mais totalement absents des muscles longitudinaux et du plexus myentérique (Ahmad and Daniel, 1991).

Les récepteurs de la neurotensine présents dans les membranes de fundus gastrique de rat se répartissent également en deux familles de haute et basse affinité (Kitabgi et al., 1984). Toutefois les expériences de marquage covalents réalisés sur ces préparations ne montrent qu'une protéine de 110 kDa (Mazella et al., 1985).

Deux familles de sites ont également été retrouvées dans l'utérus de ratte, présentant les mêmes caractéristiques pharmacologiques que les deux sites caractérisés dans le cerveau (Pettibone and Totaro, 1987).

Ces localisations correspondent bien aux effets contractants ou relaxants induits par la NT sur organes isolés (Figure 16). Dans différents organes, seuls des récepteurs de basse affinité de la neurotensine ont été mis en évidence. C'est le cas en particulier dans le cortex rénal et à un plus faible taux dans la medulla rénale de rat (Quirion et al., 1982a), ainsi que dans la couche profonde du cortex surrénalien (Goedert et al., 1984a). Toutefois, on notera que le ligand tritié de faible radioactivité spécifique utilisé pour ces expériences rend difficile la détection d'éventuels sites de haute affinité.

Chez l'homme, les ARNm codant pour le NTR1 ont été identifiés par Northern blot dans l'intestin grèle et dans les cellules sanguines mononucléaires (Vita et al., 1993). Chez le rat, par la technique de RT-PCR, les taux les plus élevés ont été retrouvés dans le côlon, le foie, le duodénum et le pancréas (Mendez et al., 1997).

- Localisation en périphérie chez la souris (données personnelles non publiées) :
L'ensemble des données que nous avons présenté ci-dessus étant très incomplet et ne concernant pas la souris qui est notre modèle d'étude, nous avons voulu réaliser une cartographie plus générale des récepteurs de haute affinité chez cet animal en périphérie. La technique mise en oeuvre, la liaison de ligand radiomarqué (25 pMol de ¹²⁵I-Tyr³-NT) sur coupes d'animal adulte entier, révélée par autoradiographie ou émulsion photosensible, nous a permis de localiser les principaux organes contenant des récepteurs de haute affinité (Figure 28). L'absence d'effet de la lévocabastine sur les liaisons observées permet d'affirmer qu'il ne s'agit pas de NTR2.

Les récepteurs sont retrouvés essentiellemnt le long du tube digestif : iléon, jejunum, duodé-num, côlon, et surtout rectum. Dans l'estomac, les récepteurs sont retrouvés exclusivement dans la partie fundique.
Aucune liaison n'a été mise en évidence dans le pancréas, la rate, le foie, les reins, la prostate ou les poumons. On peut donc supposer que les effets observés in vivo sur ces organes, par exemple la mobilisation du glycogène hépatique (Carraway et al., 1976) ou l'hyperplasie pancréatique (Feurle et al., 1985) sont soit des effets indirects, soit des effets médiés exclusivement par un site de basse affinité qui n'était pas détectable dans nos conditions opératoires.

Nous avons vu que chez le rat, les ARNm codant pour le NTR1 ont été mis en évidence dans le foie et le pancréas (Mendez et al., 1997). La discordance avec nos observations sur la souris pourrait être spécifique à l'espèce, ou traduire un niveau de maturation de la protéine très faible dans ces tissus. Au niveau cardiaque, deux types de marquage sont mis en évidence : une liaison diffuse, faible mais très spécifique sur l'ensemble du muscle, et un marquage ponctuel intense non identifié.

Enfin des taux importants de récepteurs ont été retrouvés dans les testicules et la vessie.

Ces expériences ont confirmé l'importance probable de la NT dans le fonctionnement du tractus digestif. On notera que des régions totalement dépourvues de sites de liaison de haute affinité chez l'adulte normal, comme les poumons par exemple, présentent des taux élevés chez l'embryon ou au cours des processus de cancérisation (voir dernier chapitre). Ces observations permettent de penser que la NT, par le biais de ses récepteurs de haute affinité, peut jouer un rôle de type facteur de croissance ou de différenciation et donc être associée à certaines pathologies cancéreuses.


I - F - Ontogenèse du NTR 1 :

- Système nerveux central de rat :
Le profil ontogénique du récepteur ressemble globalement à celui du peptide. Aussi bien dans le système nerveux central qu'en périphérie, il apparaît de façon précoce au cours du développement embryonnaire, augmente après la naissance, puis décroît pour atteindre le niveau adulte.

Des études par liaison de ligand radio-marqué sur coupes de cerveaux ou sur homogénat ont montré que dans le cerveau de rat, les récepteurs apparaissent dès le 14° jour embryonnaire dans le néo-cortex. Leurs taux augmentent sensiblement à partir du 18° jour embryonnaire, puis de façon spectaculaire après la naissance pour atteindre une valeur maximale le 8° jour. Les récepteurs diminuent ensuite progressivement pour atteindre à un mois la valeur retrouvée chez l'adulte (Schotte et al., 1987; Kiyama et al., 1987).

Dans le mésencéphale, les récepteurs de la NT suivent un profil de maturation différent : ils apparaîssent vers le 18° jour embryonnaire puis augmentent progressivement pour atteindre vers le 15° jour post natal la valeur présente chez l'adulte (Kiyama et al., 1987; Palacios et al., 1988).

Les mêmes observations ont été faites sur le messager du NTR1, avec un embrasement cortical spectaculaire mais transitoire au début du développement post-natal et une augmentation progressive dans le mésencéphale (Lobo et al. 1988 ; Sato et al. 1992 ; Hermans et al. 1993 ; Lepee-Lorgeoux et al., 1999). Ces résultats montrent que la baisse en récepteurs corticaux après le 8° jour correspond bien à une diminution de la synthèse.

- Système nerveux central humain :
Très peu de données étant disponibles sur le cerveau de souris et sur le cerveau humain, nous nous sommes particulièrement attachés à l'étude de ces deux modèles. Les mesures réalisées sur homogénat de cerveau (Figure 28, Zsürger et al., 1992) nous ont permis de montrer chez ces deux espèces une surexpression corticale importante et transitoire des récepteurs de haute affinité. Dans le cerveau humain, les sites de haute affinité sont présents à la naissance à une concentration 4 fois supérieure à l'adulte. Ces taux augmentent rapidement pour atteindre une valeur maximale un mois après la naissance. Puis ils diminuent progressivement : à 4 mois, ils sont au même niveau que chez le nouveau-né, et à 15 mois ils ont rejoint le niveau adulte. Pendant toute cette période les récepteurs de basse affinité sont absents : ils ne sont détectés qu'au quinzième mois post-natal.

Un profil similaire a été obtenu chez la souris, avec des échelles de temps différentes : la valeur maximale est atteinte à 8 jours et la valeur adulte à 30 jours. Ce mécanisme semble assez général chez les mammifères, avec des décalages dans la cinétique. Nous l'avons ainsi retrouvé chez le boeuf et le lapin. Toutefois, dans cette dernière espèce, on note que le maximum est déjà atteint à la naissance, et que les sites de basse affinité ne sont jamais détectés (Figure 29).

Chez l'homme, le phénomène a une ampleur particulière puisqu'à un mois, on mesure 10 à 20 fois plus de sites de liaison que chez l'adulte, alors que chez les autres espèces l'écart n'est que de 2 à 5 ordre de grandeur.

Nous avons complété cette étude de l'ontogenèse des récepteurs de la NT par une étude histologique sur coupes d'animal entier (Figure 30, données personnelles non publiées).
Nous avons ainsi montré que les récepteurs apparaissent dès le 14° jour embryonnaire au niveau cortical. Au 18° jour embryonnaire, les récepteurs sont présents dans le cortex, le mésencéphale et la moelle épinière, essentiellement dans la corne ventrale. On notera que chez le rat, les récepteurs de la neurotensine sont plutôt retrouvés dans la corne dorsale, ce qui là encore permet de penser que la NT pourrait jouer chez la souris un rôle fonctionnel différent.

Les taux maximum d'expression sont atteints au 8° jour post natal. Puis le nombre de récepteurs diminue, en particulier dans le cortex, le pons et la moelle épinière. En revanche le nombre de récepteurs dans le VTA et la substance noire varie peu.

- Ontogenèse du NTR1 en périphérie (Données personnelles non publiées) :

Nous avons vu dans l'introduction que la neurotensine semblait pouvoir jouer un rôle important de facteur trophique dans de très nombreux cancers, en particulier dans des tissus où aucun récepteur n'est détecté chez l'adulte, comme le poumon, la prostate et le pancréas. Il nous a donc semblé intéressant d'étudier l'ontogenèse des récepteurs de haute affinité en périphérie, en particulier au cours du développement embryonnaire. Ceci a été réalisé chez la souris par la technique de liaison de ligand radiomarqué sur coupes d'animal entier (Figure 31).

Les récepteurs de la neurotensine apparaissent de façon précoce chez la souris, d'abord dans le système digestif, puis pulmonaire, vasculaire et urinaire. On peut décrire trois profils de maturation selon les tissus.

Dans un premier type, les récepteurs apparaissent au cours du développement embryonnaire, atteignent une valeur maximale avant la naissance puis diminuent jusqu'à la valeur retrouvée chez l'adulte. C'est le cas du tube digestif et de la vessie. Ainsi, à 13 jours embryonnaires, les récepteurs sont déjà présents dans le tube digestif. Leur concentration augmente rapidement jusqu'au jour embryonnaire 18-19 puis diminue progressivement pour atteindre vers le quinzième jour post-natal la même valeur que chez l'adulte.

Dans un deuxième type, les récepteurs apparaissent également de façon très précoce, atteignent leur valeur maximale au cours du développement embryonnaire puis diminuent rapidement pour disparaître totalement. Ainsi, dans les reins et l'uretère la valeur maximale est retrouvée à seize jours embryonnaires, puis la concentration diminue jusqu'à être indétectable à partir du quinzième jour post-natal. De même, au quinzième jour embryonnaire, les récepteurs sont présents dans les "poumons". Leur concentration augmente sur l'arbre bronchique jusqu'au 18° jour embryonnaire puis diminue rapidement et disparaît totalement juste avant la naissance.

Dans le troisième type, les récepteurs apparaîssent après la naissance et augmentent graduellement pour atteindre plus ou moins vite leur valeur plateau retrouvée chez l'adulte. C'est le cas dans la rétine (voir plus loin), dans le cœur où un marquage diffus est présent sur l'ensemble du muscle cardiaque chez l'adulte et enfin dans le fundus où aucun marquage n'est détectable avant le quinzième jour post-natal. Nous n'avons jamais mis en évidence de site de liaison dans le foie, la rate, le pancréas, le thymus et la prostate, quel que soit l'âge étudié.

- Ontogenèse du NTR1 dans la rétine (Données personnelles non publiées) :
Les récepteurs de haute affinité ne sont pas détectables dans la rétine avant le 6° jour post-natal (Figure 32). Dès le 8°-10° jour ils sont exprimés aux mêmes taux que chez l'adulte. Cette cinétique d'apparition tardive nous a amené à penser qu'il pourrait y avoir dans la rétine une forte population de récepteurs de basse affinité En fait, la liaison de la NT sur coupes de rétine n'est pas déplacée par la lévocabastine qui se lie spécifiquement au NTR2. Une étude réalisée par RT-PCR nous a permis de confirmer que le NTR2 était effectivement absent de la rétine (résultats non montrés).

En revanche, des données d'hybridation in situ (Hermans-Borgmeyer et al., 1999) montrent la présence abondante de l'ARNm codant pour le NTR3 dans la rétine, dès le 13° jour embryonnaire. Comme aucun site de liaison n'est détectable avant le sixième jour post-natal, il est probable que la protéine ne soit pas maturée avant ce stade.

I - E - NTR1 et vieillissement cérébral (Données personnelles non publiées) :

Nous avons vu que la distribution de la neurotensine variait considérablement au cours du développement, mais elle subit aussi un certain nombre de modifications au cours du vieillissement. Il a été montré que chez le rat âgé, les taux de NT étaient notablement diminués dans le striatum, le noyau accumbens, la substance noire et l'hippocampe (De Ceballos et al., 1987; Govoni et al., 1986) et chez l'homme, dans la substance noire compacte et réticulée (Buck et al., 1981). Chez le rat, il a été observé une diminution uniforme des taux de liaison du peptide dans l'hypothalamus, le cortex, le striatum et l'hippocampe (Govoni et al., 1986). Une étude réalisée sur cerveau de souris de 6 semaines et 21 mois a mis en évidence une diminution du nombre de sites récepteurs dans plusieurs aires corticales (cingulaire et frontal), le girus denté, le striatum et le mésencéphale (Cadet et al., 1993). Cette étude, réalisée dans des conditions optimales pour détecter l'ensemble des sites de liaison, et donc particulièrement les sites de basse afinité (2 nM de ligand tritié à 4°C), ne permet pas de déterminer spécifiquement la perte en sites de haute affinité.

La connaissance et la compréhension de ces variations d'expression peut s'avérer importante pour appréhender certaines modifications fonctionnelles liées ou non au vieillissement. Deux pathologies importantes, la maladie de Parkinson et la schizophrénie, sont directement corrélées à une perte ou un dysfonctionnement des neurones dopaminergiques mésocortico-limbiques. Les interactions fonctionnelles existant entre le système dopaminergique et le système neurotensinergique permettent de penser que toute modification de l'un des deux pourra retentir sur l'autre.

Ainsi, il a été décrit chez le sujet âgé une diminution des réponses extra-pyramydales à l'halopéridol. Ces modifications pourraient être corrélées à une diminution de l'expression de la neurotensine et de ses récepteurs dans le striatum dorsolatéral, elle même induite par la diminution, liée à l'âge, des sites D2 (Dobie et al., 1993).

Nous avons voulu réaliser une étude détaillée des variations des récepteurs de haute affinité dans les cerveaux de rat et de souris, en nous plaçant dans des conditions expérimentales permettant d'éliminer la liaison au NTR2.

Ces études ont été menées sur des souris de trois souches différentes (C57-black/6, OF1 et BALB/c) et chez des rats OFA-SD en comparant la liaison de la ¹²⁵I-Tyr³NT sur coupes de cerveau d'animaux adultes jeunes (trois à cinq mois) ou âgés (21 à 24 mois). Nous avons montré que les sites de haute affinité diminuent de façon notable dans le cerveau des deux espèces. Le phénomène semble nettement plus important chez le rat, avec une diminution moyenne du nombre de sites supérieure à 50 %. La diminution est particulièrement notable au niveau cortical et dans le noyau caudé-putamen. (Figure 33).

Chez la souris, nous avons noté l'importance de la souche sur l'effet observé, avec une diminution maximale chez les black-57 (30 % en moyenne), plus modérée avec les OF1 (25 %) et faible chez les BALB/c (10 %). Les diminutions les plus importantes sont observées au niveau cortical et thalamique.

Nous avons recherché si la sensibilité au GTP variait en fonction de l'âge, dénotant ainsi une différence dans les niveaux de couplage des récepteurs. Cette étude réalisée avec des BALB/c n'a pas permis de montrer de différence statistiquement significative entre les deux lots de souris, bien que les cerveaux âgés aient semblé présenter une plus grande sensibilité au GTP (résultats non montrés).

Enfin, nous avons recherché si ces diminutions importantes en sites de haute affinité pouvaient avoir un retentissement fonctionnel mesurable. Pour celà, nous avons réalisé deux séries d'expériences visant à mesurer la sensibilité de ces souris à un test d'analgésie (test de la plaque chaude) et à un test d'hypothermie. Ces expériences ont été menées sur des souris black-C57 de 3 et 24 mois. Aucune différence significative de sensibilité à la neurotensine dans la réponse à la douleur et au froid n'a été relevée entre les deux lots (résultats non montrés).

Ces résultats suggèrent deux commentaires. Tout d'abord, la difficulté d'obtention d'animaux âgés nous a contraints à travailler sur de très petites populations (10 animaux) et la dispersion des résultats a rendu impossible une interprétation statistique des résultats.

D'autre part, nous avons montré dans les chapitres précédents que ces deux propriétés de la NT ne semblaient pas médiées par le NTR1 (Dubuc et al., 1994; Dubuc et al., 1999b). On peut donc supposer que la diminution en sites de haute affinité que nous avons observée ne s'applique pas nécessairement au ou aux autres sites responsables de ces effets.