Deuxième partie : Les récepteurs de la neurotensine :

II - Le NTR2 :

II - A - Présentation :

Un ADNc de 1,6 kb, codant pour un récepteur de 416 acides aminés a été cloné par homologie avec le NTR1 à partir d'une banque de cerveau de souris (Mazella et al., 1996). La séquence nucléique codant pour le NTR2 de rat a été clonée à partir d'hypothalamus en utilisant la même stratégie (Chalon et al., 1996). Les deux protéines ont le même nombre d'acides aminés et présentent 95% d'homologie entre elles et environ 40 % d'identité avec le NTR1. Enfin la séquence du NTR2 humain a été clonée à partir de cortex (Vita et al., 1998). La protéine est légèrement plus courte (410 acides aminés) (Figure 34). Le profils d'hydrophobicité de sa séquence protéique classe le NTR2 dans la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires.
La masse moléculaire de la protéine exprimée de façon stable dans les cellules HEK 293, et déterminée par liaison covalente avec un dérivé photoactivable de la NT (azidobenzoyl-¹²⁵I-Tyr³-Trp¹¹-NT), est de 45 kDa (Botto et al., 1998).

Le NTR2 présente une extrémité amino terminale beaucoup plus courte que le NTR1 mais une troisième boucle intra-cytoplasmique plus longue.

Deux particularités sont à souligner. Le NTR2 ne présente pas de site de N-glycosylation. L'aspartate présent dans le 2° segment transmembranaire (TM2) du NTR1 qui est très conservé dans les RCPG et qui leur confère leur sensibilité au sodium est absent dans la séquence du NTR2. Des expériences de mutagenèse dirigée ont permis de montrer qu'en remplaçant l'Ala 79 du TM2 par un Asp, on resensibilise le récepteur au sodium (Martin et al., 1999).

Un ADNc variant de 1,3 kb codant pour une protéine de 282 acides aminés a été cloné à partir d'une banque de cerveau de souris (Botto et al., 1997c). Ce variant d'épissage résulte d'une délétion de 181 codons au niveau de la région codant pour le cinquième domaine transmembranaire. La protéine exprimée dans les cellules COS-7 ne reconnaît pas la neurotensine. Des expériences d'amplification par RT-PCR ont montré que ce variant avait une localisation particulière. Il peut être coexprimé avec le récepteur normal (cortex, cervelet, striatum, bulbes olfactif et hypothalamus), ou n'être que très faiblement exprimé (mésencéphale) ou au contraire être la forme majoritaire (moelle épinière). Il n'est donc pas exclu que ce variant code pour une protéine qui joue un rôle fonctionnel spécifique non encore déterminé.


II - B - Propriétés de liaison :

Nous avons vu que les NTR2 natifs caractérisés dans les cerveaux de souris, de rat et humain présentaient des propriétés de liaison similaires pour la NT, avec une affinité de 3 à 5 nM et que la liaison était antagonisée par la lévocabastine.

Les trois récepteurs clonés et exprimés semblent présenter un certain nombre de propriétés pharmacologiques distinctes. Ainsi le NTR2 de souris exprimé dans les cellules COS-7 présente une affinité semblable, de 1 à 3 nM, pour les composés suivants : NT, NN, lévoca-bastine, Trp¹¹-NT et xénine (Mazella et al., 1996).

En revanche, le NTR2 de rat exprimé dans les mêmes cellules présente une affinité de 0,77 nM pour la NT et de 5,1 nM pour la NN.
Le NTR2 humain est moins sensible à la lévocabastine que les deux précédents (91 nM) (Vizi and Kiss, 1998) ce qui avait déjà été décrit pour le récepteur natif (Schotte et al., 1986).

L'antagoniste non peptidique SR48692 développés par Sanofi a globalement une moins bonne affinité pour le NTR2 que pour le NTR1 avec des différences selon l'espèce : 22 nM pour le rat (Chalon et al., 1996), 200 nM pour la souris (Mazella et al., 1996) et 67 nM pour l'homme (Vita et al., 1998). L'antagoniste de deuxième génération, le SR142948A reconnaît avec une affinité similaire (1 à 4 nM) le NTR1 et le NTR2 de rat et de souris.


II - C - Systèmes de transduction :

Le NTR2 a longtemps été considéré comme un "accepteur" de NT plutôt que comme un récepteur devant traduire un message neurotensinergique. L'absence de modèle cellulaire exprimant le NTR2, et en particulier l'absence du NTR2 sur les neurones en culture primaire, n'avait pas permis de montrer d'activation de seconds messagers médiés par ce récepteur.
L'expression du NTR2 cloné a permis de mettre en évidence un certain nombre de réponses intracellulaires induites par l'activation de ce récepteur.

Lorsque l'ARNm codant pour le NTR2 de souris est injecté dans l'ovocyte de xénope, la NT induit l'activation d'un courant chlore entrant, dépendant du calcium. Il faut noter que dans ce modèle, la lévocabastine (Mazella et al., 1996) et le SR48692 (Botto et al., 1997b) se comportent comme des agonistes du NTR2.
Lorsque le NTR2 de rat est exprimé dans les cellules CHO, la lévocabastine et le SR48692 se comportent également comme des agonistes et induisent une mobilisation du calcium intra-cellulaire alors que la NT et le JMV40 (un analogue non dégradable de la NT) n'y parviennent que faiblement (Yamada et al., 1998).

L'expression du NTR2 humain dans ces mêmes cellules CHO a donné des résultats encore plus inattendus. La NT, la NN, la xénine et la lévocabastine n'induisent aucune réponse intra-cellulaire. En revanche, le SR48692 et le SR142978A induisent la mobilisation du calcium intracellulaire, la production d'IP3, la libération d'acide arachidonique et l'activation des MAP-kinase (Vita et al., 1998). De façon surprenante, ces activités sont spécifiquement antagonisées par la NT et la lévocabastine.

L'ensemble de ces résultats tendrait à prouver que le NTR2 humain cloné pourrait être fonctionnellement couplé mais activé par un ligand endogène inconnu, la NT jouant alors le rôle d'un agoniste inverse.

Il n'est toutefois pas certain que les couplages observés dans une cellule surexprimant un récepteur cloné rendent compte du fonctionnement normal du récepteur natif. Il a ainsi été montré dans des liposomes contenant à la fois les récepteurs M2 et la protéine Go, qu'un agoniste M2 (l'alcuronium) pouvait soit augmenter soit inhiber l'activité de Go selon le rapport stœchiométrique entre les récepteurs et les protéines-G (Tucek, 1997). Dans un système cellulaire surexprimant fortement un récepteur cloné, l'activité basale constitutive de celui-ci devient prépondérante. C'est ainsi que certains ligands, précédemment décrits comme des antagonistes s'avèrent être des agonistes inverses. C'est le cas par exemple d'un antagoniste H2, la cimétidine, vis-à-vis du récepteur H2 cloné et surexprimé dans les cellules CHO (Smit et al., 1996). Ceci peut expliquer que la NT et la lévocabastine semblent assurer des fonctions différentes vis-à-vis du NTR2 selon le système d'expression étudié.

De fait, une études menée sur des tranches de cerveau de rat semble montrer que dans ce système, la NT agit comme un agoniste du NTR2. En effet, la NT induit une hyperpolarisation des astrocytes ; ce mécanisme est fonction de la concentration en peptide et spécifiquement antagonisé par le SR48692 (Hosli et al., 1995). De même, une étude récente sur culture primaire mixte neurones-astrocytes a mis en évidence l'induction par la neurotensine d'une libération de calcium intracellulaire dans les astrocytes. Cette libération est antagonisée par un inhibiteur de la phospholipase-C mais n'est pas modifiée par la lévocabastine (Trudeau, 2000).

Toutefois il est important de noter que les astrocytes, et à plus forte raison les cultures mixtes astrocytes-neurones sont déjà des systèmes complexes présentant d'autres sous types de récepteurs : le NTR3 dans les cellules gliales (Nouel et al., 1999) et les neurones (Chabry et al., 1993) et le NTR1 dans les neurones. Les signaux observés peuvent donc résulter de l'intervention directe ou indirecte de ces autres sous-types de récepteurs.

L'ensemble de ces expériences montrent que les observations réalisées dans les cellules où le NTR2 est artificiellement surexprimé ne rendent pas compte des mécanismes qui interviennent dans les cellules où il est normalement exprimé.

Agoniste, agoniste inverse ou antagoniste, les études à venir devront éclaircir le rôle de la NT vis-à-vis du NTR2 natif.


II - D - Internalisation du NTR2 :

Dans les cellules HEK293 exprimant le NTR2 de souris, la NT induit l'internalisation du complexe ligand-récepteur (Botto et al., 1998). L'endocytose de la ¹²⁵I-Tyr³-NT (t_1/2, 10 min) est suivie d'un recyclage du NTR2 à la surface cellulaire. Ce mécanisme est inhibé par la monensine.

Nous avons signalé dans le chapitre précédent que le NTR1 n'est recyclé dans aucun des modèles cellulaires où il a été étudié. Cette différence dans le devenir intracellulaire du NTR2 et du NTR1 est probablement la conséquence de divergences de séquence ; nous avons vu que l'internalisation du NTR1 était directement dépendante des acides aminés Thr-422 et Tyr-424 de l'extrémité carboxy-terminale. En revanche, l'endocytose du NTR2 dépend de l'intégrité de sa troisième boucle intracellulaire (résultats non publiés).

Une étude par microscopie confocale avec une dérivé fluorescent de la NT a montré que les récepteurs NTR2 portés par les cellules gliales en culture primaire (mésencéphale et cortex de rat nouveau-né) n'étaient pas internalisés après liaison avec le ligand (Nouel et al., 1997).


II - E - Localisation du NTR2 :

- Le système nerveux central :
Contrairement au NTR1 qui semble exclusivement exprimé par les neurones, le NTR2 a une double localisation neuronale et gliale.

La présence du NTR2 sur des cellules gliales a été très vite suspectée. En effet, ce récepteur a une distribution régionale beaucoup plus diffuse que le NTR1, son ontogenèse est calquée sur la mise en place du tissu glial et après une lésion à l'acide kaïnique on assiste à une récupération rapide et même une surexpression du NTR2 alors que le NTR1 disparaît (Nouel et al., 1999; Schotte et al., 1988). De même au cours de la maladie de Parkinson qui se traduit par une perte importante en neurones mésencéphaliques, seuls les sites de haute affinité disparaissent alors que les sites de basse affinité ne sont pas affectés (Sadoul et al., 1984a).

Le NTR2 a été mis en évidence sur cellules gliales de rat en cultures primaires (Nouel et al., 1997; Nouel et al., 1999). Sur ces cellules existe une seule population de sites de basse affinité (6 nM) dont la liaison est déplaçable par la lévocabastine. Les techniques d'hybridation in situ et de RT-PCR ont permis de montrer la présence des transcrits codant pour le NTR2 mais aussi pour le NTR3 et l'absence du NTR1.

Les ARNm du NTR2 sont également présents dans les neurones. Une étude par hybridation in situ et observation microscopique a montré que dans le cerveau de souris, cette localisation était nettement majoritaire (Sarret et al., 1998). En revanche, il n'a jusqu'à présent jamais été possible d'obtenir de neurones en culture primaire exprimant le NTR2.

La localisation régionale du NTR2 a d'abord été réalisée de façon indirecte par liaison de neurotensine radiomarquée en présence ou en absence de lévocabastine sur cerveau de rat (Figure 24) (Kitabgi et al., 1987; Schotte et al., 1986). Ces expériences ont permis de mettre en évidence une localisation des récepteurs de type 2 plus diffuse que celle des récepteurs de type 1. Les concentrations les plus importantes sont retrouvées dans certaines aires corticales (cortex préfrontal, pariétal et occipital), dans la formation hippocampale (CA1 et subiculum dorsal), dans certains noyaux thalamiques (noyaux rouge, prétectal et genouillé latéral) et dans les tubercules quadrijumeaux antérieurs. En revanche, les sites de liaison du NTR2 sont absents du reste du mésencéphale (substance noire et aire tegmentaire ventrale en particulier), de l'hypothalamus, du girus denté, des ganglions de la base, des cortex cingulaire et rétrosplénial et de la couche plexiforme externe des bulbes olfactifs.

L'ARNm codant pour le NTR2 a ensuite été localisé par Northen-blot (Chalon et al., 1996; Mazella et al., 1996; Vita et al., 1998) et surtout par hybridation in situ (Sarret et al., 1998; Walker et al., 1998).

Chez la souris (Sarret et al., 1998), les ARNm codant pour le NTR2 sont retrouvés essentiellement au niveau des cortex cérébraux (piriforme et rétrosplénial en particulier) et cérébelleux (couche granulaire), des tubercules olfactifs et des bulbes olfactifs (couches mitrale et granulaire), de la formation hippocampale, du complexe amygdalien, de l'habenulla médiane, de l'hypothalamus (noyaux suprachiasmatique, arqué, ventro et dorso médian), des tubercules quadrijumeaux antérieurs et postérieurs (Figure 35). Ces localisations semblent concerner particulièrement le système auditif (noyau de l'olive supérieure et cochléaire ventral, tubercules quadrijumeau postérieurs et corps genouillé médian).

On peut noter que de nombreux sites portant les ARNm codant pour le NTR2 sont également des sites portant les récepteurs de haute affinité. En revanche l'habenulla médiane et le cervelet ne présentent pas de sites de liaison de haute affinité détectables (Figure 26).Chez le rat, les ARNm codant pour le NTR2 sont retrouvés en densité élevée dans les cellules épendymaires périventriculaires et la pie-mère, le noyau arqué de l'hypothalamus et les corps mammillaires ; à plus faible densité, dans le subiculum, le noyau hypothalamique périventriculaire, la substance noire et l'aire ventrotegmentale, les tubercules quadrijumaux antérieurs, les noyaux cochléaires et vestibulaires et les cellules de Purkinje du cervelet (Walker et al., 1998).
Deux différences importantes sont à noter par rapport à la souris. D'une part la présence de l'ARNm du NTR2 dans les cellules épendimaires et de la pie-mère chez le rat, et d'autre part la localisation du NTR2 dans le cervelet sur les cellules de Purkinje alors que chez la souris ils se retrouvent sur les cellules granulaires. On ne sait pour le moment quelle signification attribuer à la présence des ARNm dans les cellules épendymaires et de la pie-mère puisque aucun site de liaison n'a jamais été détecté dans ces tissus.

En conclusion, on constate, comme pour le NTR1, que d'une part il n'y a pas toujours concordance entre la cartographie des sites de liaison et la cartographie des messagers correspondants, et que d'autre part il existe de nettes différences en fonction de l'espèce.

- La périphérie :
Les récepteurs de basse affinité ont été localisés par liaison de ligand radiomarqué dans le tractus digestif (fundus de rat, (Kitabgi et al., 1984), l'iléon de chien (Ahmad et al., 1987; Ahmad and Daniel, 1991) et le jéjunum de porc (Seybold et al., 1990), la medulla rénale (Quirion et al., 1982a), le cortex surrénalien (Goedert et al., 1984a), et l'utérus de rat (Pettibone and Totaro, 1987). Ils présentent sensiblement les mêmes propriétés pharmacologiques que les sites caractérisés dans le cerveau. Les ARNm correspondant n'ont pas encore été cartographiés.


II - F - Ontogenèse du NTR2 :
Annexe 1 (Zsürger et al., 1992)
Des études d'ontogenèse des récepteurs de basse affinité dans le système nerveux central ont été réalisées chez le rat (Schotte and Laduron, 1987), la souris et l'homme (Zsurger et al., 1992). Elles montrent que ces sites ne sont exprimés qu'au cours du développement post-natal et atteignent leur valeur adulte après une augmentation assez lente et progressive (Figure 29). Ainsi chez la souris, les sites de basse affinité apparaissent à partir du 10° jour post-natal et atteignent leur valeur maximale à l'âge adulte, c'est-à-dire à deux mois. Le profil ontogénique du rat est sensiblement identique. Chez l'homme, les récepteurs de basse affinité ne sont pas détectés avant 15 mois.

L'ontogenèse des ARNm codant pour le NTR2 a été réalisée chez le rat (Lepee-Lorgeoux et al., 1999) et la souris (Sarret et al., 1998). Ces études sont en accord avec les données précédemment citées. Chez la souris, les ARNm deviennent détectables à partir du 14° jour postnatal dans les cellules pyramidales de l'hippocampe et du cortex piriforme, puis dans les autres aires. Les valeurs augmentent progressivement jusqu'à l'âge adulte (Figure 40).

Chez le rat, la transcription des ARNm codant pour le NTR2 semble beaucoup plus précoce puisque qu'ils sont déjà présents à la naissance dans les cellules épendymaires et à partir du 5° jour post-natal dans les autres zones. On notera toutefois que la protéine fonctionnelle corres-pondante n'est pas délivrée à la membrane avant le 15° jour postnatal.