Deuxième partie : Les récepteurs de la neurotensine :

III - Le NTR3 :

III - A - Purification et clonage :

Le NTR3 est un récepteur totalement différent des deux précédents : il s'agit d'une protéine d'environ 800 acides aminés, présentant un seul domaine transmembranaire, une courte extrémité cytoplasmique et une longue portion extra-cellulaire (Figure 36). La protéine porte dans sa partie amino-terminale un site de clivage pour la furine qui présente une importance stratégique pour la liaison de la neurotensine. Le NTR3 ou GP95/sortiline ou gp110 a été identifié, purifié et cloné par trois approches différentes qui correspondent à trois fonctions différentes de cette protéine.


La gp95/sortiline : purification et clonage :
La RAP est une protéine endoplasmique de 40 kDa présente au niveau du réticulum et du golgi qui joue un rôle important dans l'adressage des récepteurs de la famille des récepteurs des lipoprotéines de faible densité (LDL, low-density lipoprotein).

La RAP se lie à la calmoduline et est phosphorylée par une kinase dépendante de la calmoduline (Petersen et al., 1996). Des protéines d'environ 100 kDa liant également la RAP ont été identifiées à partir de cellules CHO (Battey et al., 1994), d'ostéosarcome (Gliemann et al., 1994) et de cerveau humain (Petersen et al., 1997). Une de ces protéines a été purifiée sur colonne d'affinité (Sépharose-RAP) à partir d'extrait de cerveau humain solubilisé par le détergent CHAPS (Petersen et al., 1997).

Il s'agit d'une glycoprotéine de 95 kDa qui se lie à la RAP de façon spécifique puisque la liaison au ligand radiomarqué est entièrement déplacée par 100 nM de RAP froide. En revanche, cette liaison n'est absolumemt pas inhibée par un antagoniste de la liaison au LDL (urokinase-plasminogène) ce qui prouve que cette protéine ne fait pas partie de la famille des récepteurs des LDL.

Des séquences partielles obtenues par attaque trypsique de la protéine purifiée ont servi à générer des oligonucléotides qui ont permis, par criblage d'une banque de ADNc de cellules Jurkat, d'isoler un clone de 4,5 kb.

La séquence protéique de la gp95/sortiline ne présente pas d'identité avec la séquence des récepteurs LDL. En revanche, elle présente une forte homologie avec les récepteurs de la famille de Vps10p, un récepteur qui intervient dans l'adressage de la carboxypeptidase Y chez la levure (Marcusson et al., 1994). Cette nouvelle famille comprend également les récepteursSorLA (Jacobsen et al., 1996) et SorCS (Hermey et al., 1999).

Tous ces récepteurs présentent une forte homologie structurelle résumée dans la Figure 37. On notera deux points particuliers :

- Tout d'abord la présence dans l'extrémité carboxyterminale d'une séquence homologue à la partie correspondante de CI-M6PR, le récepteur du mannose 6-phosphate et de l'insulin like growth-factor-II (IGF-II) (Petersen et al., 1997).

- D'autre part la présence d'un site de coupure par la furine juste avant l'extrémité amino terminale. Les deux récepteurs purifiés par colonne d'affinité, c'est-à-dire sur la base de leur activité de liaison (gp95 et NTR3) ont permis de déterminer une extrémité amino-terminale correspondant à la protéine déjà clivée par la furine. Il semble donc que cette coupure soit la dernière étape de la maturation du prorécepteur aboutissant au récepteur actif.
Nous verrons dans le chapitre suivant que l'intervention de la furine sur le pro-NTR3 génère effectivement un NTR3 présentant une affinité élevée pour la NT.

On ne sait pas pour le moment si le peptide de 5 kDa libéré par cette coupure a lui aussi un rôle physiologique à jouer. Mais il a déjà été montré qu'il était lui même ligand de la sortiline, faisant compétition à la liaison de la RAP et de la NT (Munck Petersen et al., 1999). Il pourrait donc intervenir dans la régulation du message médié par la NT, par exemple en faisant compétion au ligand, après internalisation du complexe ligand-récepteur.

Le gène codant pour la gp95/sortiline a été localisé par hybridation in situ sur la partie proximale du bras court du chromosome 1 (Petersen et al., 1997).



Le récepteur NTR3 de la neurotensine :

Purification du récepteur NTR3 (Mazella et al., 1989; Zsürger et al., 1994) :
Dans le but initial de purifier le NTR1 sur colonne d'affinité à partir de cerveau de souris et d'humain nouveau-né, nous avons solubilisé l'activité de liaison par le détergent CHAPS. Des marquages covalents par un agent réticulant (DSS, disuccinimidyl subérate) ou par un dérivé photoactivable de la neurotensine (azydo benzoyl neurotensine 2-13) ont mis en évidence une protéine unique de poids moléculaire 100 kDa. Ce poids moléculaire a été confirmé par une expérience de tamisage moléculaire (Figure 38 A). Les paramètres testés (affinité, relations structure-fonction, sensibilité au sodium) montrent que la protéine solubilisée, brute ou purifiée, possède sensiblement les mêmes propriétés de liaison que le NTR1. En revanche elle a bien sûr perdu sa sensibilité au GTP.

Le récepteur a été purifié en une seule étape grâce à une colonne d'affinité (NT2-13 Ultrogel ACA22). Le principe de cette purification est détaillé dans la Figure 38 B.

Clonage du NTR3 purifié (Mazella et al., 1998) :
La protéine purifiée sur colonne d'affinité a subi une deuxième étape de purification par électrophorèse préparative et a été séquencée (dégradation d'Edman). Les séquences amino terminales obtenues à partir de cerveau humain (23 acides aminés) de rat et de souris présentent une forte homologie entre elles. La séquence nucléotidique dérivée de la séquence peptidique humaine a servi à cribler une base de données d'ADNc de rétine humaine et à identifier un clone identitique. Les séquences nucléotidiques dérivées ont servi à cribler une banque d'ADNc de cerveau humain. Les clones positifs se sont avérés, après séquençage, être 100 % identiques à la gp95/sortiline qui venait juste d'être clonée (Petersen et al., 1997).

Comme il a déjà été expliqué plus haut, la séquence amino-terminale que nous avions obtenue n'est pas la séquence amino-terminale de la gp95, mais se trouve en aval du site de coupure de la furine (Figure 36).

Le NTR3 a été exprimé de façon transitoire dans des cellules COS-7. La NT ne se lie pas aux aux préparations membranaires. On peut donc admettre que le NTR3 n'est que très peu exprimé à la membrane, ce qui avait déja été montré sur neurones en culture primaire (Chabry et al., 1993).

En revanche, après solubilisation par le détergent CHAPS, on observe une liaison saturable et réversible présentant sensiblement les mêmes relations structure-fonction que le récepteur natif vis-à-vis des analogues de la NT. On notera toutefois que la Trp¹¹NT a la même affinité que la NT alors qu'elle avait une affinité dix fois moins bonne vis-à-vis du récepteur solubilisé dans le cerveau (Zsürger et al., 1994).

Le SR48692 et la lévocabastine ne sont pas reconnus par le NTR3 en revanche, la D-Trp¹¹-NT n'est que 4 fois moins affine que la NT (64 nM) alors qu'elle n'était pas du tout reconnue par le récepteur natif (> 10 mM). Il se pourrait donc qu'une partie des activités pharmacolo-giques des dérivés substitués sur la Tyr¹¹ par un acide aminé dextrogyre soient médiées par ce récepteur.

Les paramètres cinétiques sont beaucoup plus rapides puisque l'équilibre est atteint en 3 minutes contre 50 minutes pour le récepteur natif. Ce résultat peut résulter de la grande quantité de récepteurs exprimés par ces cellules, quantité bien supérieure à celle qui est naturellement retrouvée dans les tissus.

Les expériences de saturation à l'équilibre montrent également une affinité très différente, de l'ordre de 10 nM (0,3 nM pour le récepteur purifié). Nous avons supposé que la coupure par la furine pouvait être cruciale pour la liaison NT-NTR3. Pour tester cette hypothèse, le NTR3 a été cotransfecté avec la furine dans les COS-7. Les cellules obtenues expriment deux sites de liaison solubilisables au CHAPS (Figure 39) : un site majoritaire de basse affinité mais aussi un site de haute affinité (0,3 nM) présentant un poids moléculaire un peu inférieur correspondant au poids moléculaire de la protéine après coupure par la furine (100 kDa contre 110 kDa pour la protéine entière).

Cette expérience confirme donc l'importance de la coupure par la furine : la gp95 représenterait en fait un prorécepteur devant subir une dernière maturation par la furine pour se lier avec une affinité optimale (0,3 nM) à la NT. Toutefois, la gp95/sortiline, avec une affinité de 10 à 20 nM est parfaitement capable de lier la neurotensine.

- La gp110 : purification et clonage :
Chez les mammifères, la régulation du taux de glucose plasmatique est une cascade d'événements qui se termine par le transfert du glucose dans les cellules par le Glut-4. Les vésicules contenant le Glut4 ont été isolées grâce à un anticorps anti Glut4, et leur contenu en protéines étudié (Kandror and Pilch, 1994a). Quatre glycoprotéines majoritaires ont été identifiées : la gp110, la gp160, la gp180 et la gp230. La gp160 est l'IRAP, une aminopeptidase régulée par l'insuline (Kandror and Pilch, 1994b; Kandror et al., 1994; Keller et al., 1995) ; la gp180 est le récepteur de la transferrine (James and Piper, 1994) ; la gp230 est le récepteur IGF-II/Man-6-P (Kandror and Pilch, 1996).

La gp110 a été purifiée à partir d'adipocytes de rat en trois étapes : digestion des adipocytes par la collagénase, fractionnement subcellulaire par centrifugation différentielle, et tri des microsomes légers par immunoadsorption (Lin et al., 1997). Après séparation des protéines par électrophorèse, et digestion trypsique de la protéine de 110 kDa, un des peptides obtenus a été identifié comme étant identique à une séquence de la gp95/sortiline. Le clonage de la protéine a confirmé que la gp 110 était bien la sortiline de rat.

III - B -Expression du NTR3 :

- Localisation :

Le NTR3 a initialement été localisé au niveau vésiculaire dans des cultures primaires de neurones (Chabry et al., 1993). L'intervention du peptide et l'intégrité des mécanismes d'internalisation est indispensable pour permettre la translocation du récepteur à la membrane. Les mécanismes qui régissent ce processus ne sont pas élucidés.

La sortiline et la gp110 ont également été identifiées au départ comme étant localisées sur des vésicules, respectivement au niveau du cerveau et des adipocytes. Dans les adipocytes de rat, la translocation du récepteur à la membrane est induite par l'insuline (Lin et al., 1997; Morris et al., 1998). Le récepteur cloné et exprimé dans des cellules COS-7 ou dans des CHO est également essentiellement localisé au niveau du réticulum endoplasmique et du Golgi (Mazella et al., 1998; Petersen et al., 1997). Dans les cellules CHO, 8% de la sortiline synthétisée est exprimée à la membrane (Nielsen et al., 1999).

Les travaux en cours dans notre laboratoire ont permis de montrer que le récepteur recruté à la membrane par la NT était rapidement internalisé après liaison. Il semblerait ensuite que le trafic intracellulaire du récepteur internalisé assure le transfert du peptide au noyau. Ce résultat est à mettre en parallèle avec l'ensemble des données de la bibliographie montrant que la NT pourrait intervenir dans les mécanismes de prolifération (voir plus loin, neurotensine et pathologies).

Peu de données sont encore disponibles sur la localisation régionale de la protéine. Selon que la recherche porte sur l'activité de liaison de la NT, la sortiline, la gp110, ou l'ARNm codant pour la sortiline, les données disponibles sont assez contradictoires. Les études que nous avons menées sur le NTR3 montrent sa présence dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière) chez tous les mammifères étudiés. En revanche chez la souris, après solubilisation avec le détergent CHAPS, aucune activité de liaison n'a été détectée dans les tissus suivants : testicules, prostate, pancréas, reins, foie, cœur, poumons et muscles squelettiques (résultats personnels non publiés, Tableau 5).

Chez l'homme, la localisation des ARNm codant pour la sortiline a montré la présence de deux transcrits de 8 et 3,5 kb. La protéine semble assez ubiquitaire puisqu'on la retrouve dans de nombreux organes (Tableau 5). Elle est bien sûr présente dans les trois tissus qui ont permis sa purification et son clonage : cerveau, adipocytes et muscle squelettique. Au niveau du système nerveux central, l'ARNm a été retrouvé non seulement dans les neurones mais aussi dans les cellules gliales (Nouel et al., 1999), et au niveau de la rétine (résultats non publiés). Dans le cerveau de rat adulte, l'ARNm du NTR3 est exprimé de façon diffuse avec un taux d'expression élevé dans l'hippocampe et le cortex, en particulier les cortex cingulaire, piriforme et rétrosplénial. A un moindre degré, au niveau du thalamus ventral et des tubercules quadrijumeaux postérieurs (Hermans-Borgmeyer et al., 1999). Aucune donnée ne permet pour le moment de corréler la présence de ces ARNm à celles de l'activité de liaison de la NT.

On peut noter que le système nerveux central est le seul organe où l'on ait retrouvé à la fois la gp95/sortiline, son ARNm et l'activité de liaison du NTR3. Partout ailleurs, nous n'avons pas pu mettre en évidence de récepteur de la NT actif. On peut donc imaginer que les diverses fonctionnalités de cette protéine dépendent de processus de maturation différents selon la localisation cellulaire et/ou subcellulaire.


- Maturation et ontogenèse :

Chez la souris, au cours du développement embryonnaire, le transcrit du NTR3 apparaît de façon très précoce dès le 7ème jour embryonnaire au niveau ectodermique ; du 9ème au 13ème jour les concentrations les plus importantes sont retrouvées sur l'ensemble du tube neural mais plus particulèrement au niveau des cellules en cours de division ou déjà en cours de différenciation. Les taux d'expression diminuent ensuite pour ne persister qu'au niveau cortical et hippocampal et dans la rétine (Hermans-Borgmeyer et al., 1999). Ce profil ontogénique permet de supposer que le NTR3/sortiline pourrait intervenir de façon très spécifique dans la mise en place du système nerveux central.
En périphérie, une expression plus faible est enregistrée dans de nombreux tissus comme le coeur, le muscle, le cordon ombilical, le rein les viscères et le poumon (Hermans-Borgmeyer et al., 1999).

L'expression de l'activité de liaison de type NTR3 dans le système nerveux central semble calquée sur celle du NTR1 avec une surexpression importante et transitoire au début du développement post-natal (Zsürger et al., 1992).

Dans certains tissus, l'ARNm codant pour la sortiline n'apparaît qu'après différenciation fonctionnelle des cellules : c'est le cas dans les adipocytes 3T3-L1 ou dans les myoblastes (Lin et al., 1997).

Les fonctions du NTR3 sont pour le moment hypothétiques car trop peu de données sont disponibles. Cette protéine a la particularité d'avoir une double localisation subcellulaire : une petite fraction est constitutivement exprimée à la membrane (10% au maximum) et le reste est intracellulaire. Il est donc possible d'imaginer des fonctions différentes pour la petite population de récepteurs membranaires et pour les récepteurs intracellulaires.

Nous avons vu que la sortiline subit sa dernière étape de maturation, la coupure par la furine, au niveau du trans-Golgi (Munck Petersen et al., 1999). Elle peut alors se lier au propeptide qui vient d'être libéré, mais elle pourrait aussi se lier à la proneurotensine présente dans les mêmes compartiments et assurer leur adressage vers une voie de sécrétion. De même sa présence sur les vésicules contenant le Glut4 permet de penser qu'elle intervient, comme le CI-M6PR dans l'adressage au niveau du trans-golgi.

Les récepteurs présents à la membrane peuvent quant à eux jouer leur rôle de récepteur liant un messager extracellulaire. Leur internalisation étant très rapide, ils peuvent ainsi participer à la clairance du ligand qui sera dégradé au niveau lysosomial, comme c'est le cas, par exemple, pour la lipoprotéine lipase (LpL) (Nielsen et al., 1999).

Mais ils pourraient aussi assurer un recyclage rapide de la molécule messagère dans le milieu extracellulaire puisque leur expression à la membrane est stimulable par la NT ou l'insuline.
Enfin, des travaux en cours dans notre laboratoire semblent montrer que le NTR3 assure le transfert de la NT jusqu'au noyau où celle-ci pourrait stimuler des facteurs de transcription (résultats non publiés).

Les implications physiologiques de ces nombreuses fonctions sont encore à explorer : mécanismes prolifératifs, métabolismes lipidiques et glucidiques, neuromodulation. Il est probable que l'étude du NTR3 apportera une lumière nouvelle sur la compréhension des fonctions physiologiques de la neurotensine.

Cet aspect est abordé dans le dernier chapitre présentant quelques pathologies qui pourraient être associées à la neurotensine.