2. Classification des phytases :

2.1 Les Histidine Phytases :

2.1.1.Structure de l’enzyme :

La structure de l’enzyme peut être divisée en deux domaines, un grand appelé domaine a/b , et un deuxième nommé domaine a. Le domaine a/b est constitué de six feuillets plissés b , parmi lesquels les feuillets A,B,C,D sont parallèles, tandis que les autres A,E,F sont antiparallèles. Du côté N-terminal du feuillet central, deux longues hélices a c,d sont présentes. Du côté C-terminal, deux longues hélices a k,l ainsi que deux autres plus petites m,n sont aussi présentes.

Le domaine a en revanche est constitué d’une hélice a centrale, ainsi que de sept hélices a disposées autour et nommées : a, b, e, f, g, i, j.

Au milieu de ces deux domaines, une poche profonde, limitée par l’extrémité N-terminale de la protéine (à la façon d’un couvercle) ; contient les acides aminés impliqués dans le mécanisme de réaction ; à savoir l’Arg58, l’His59 ainsi que les autres acides aminés constituant la séquence motif RHGxRxP, caractéristique de ce type de phytases.

Dans toute la séquence, dix cystéines ont été aussi identifiées, constituant ainsi cinq ponts disulfure responsables de maintenir la structure tridimensionnelle indiquée.



Schéma 2 : Représentation schématique de la structure à deux domaines de A. niger (ficuum) phytase.
Les ponts disulfure sont représentés en lignes "en éclair", le domaine a/b en rouge, et le domaine a en vert.

Une analyse de similarité structurelle avec d’autres protéines a été réalisée, donnant comme résultat une forte similarité avec l’acide phosphatase du rat, mais plutôt au niveau du domaine a /b ; de la même façon, le même résultat a été obtenu pour la phosphoglycérate mutase. Des études postérieures ont montré que cette structure à deux domaines est très caractéristique des enzymes de cette famille, présentant certaines variantes entre elles.

Pour le cas de l’acide phosphatase du rat, bien que le domaine a /b présente une forte similarité avec celui de la phytase de A. niger, les domaine a sont clairement différents, présentant une seule hélice en commun, à savoir l’hélice j (A. niger phytase) et l’hélice 7 pour l’acide phosphatase du rat 6 .

Un autre point à observer est que ces deux enzymes n’hydrolysent pas le même substrat . En effet, la phytase de A. niger hydrolyse les liaisons phosphodiester du phytate, tandis que l’acide phosphatase du rat hydrolyse plutôt des substrats de plus petite taille. Une autre différence frappante au niveau de la structure de cette enzyme est que celle-ci présente un canal à solvant qui traverse le site catalytique. Ceci dû au fait que l’extrémité N-terminal qui ferme la poche du site actif de la phytase de A. niger est plus courte chez la phosphatase acide du rat ; ainsi, bien que cette différence structurelle puisse jouer un rôle important dans la catalyse, la raison exacte de son influence est encore à élucider.

La structure cristalline d’une autre enzyme ; la phytase de E. coli; appartenant aussi à la famille des Histidine acide phosphatases avec une grande affinité par le phytate a été déterminée récemment (9).

Cette enzyme présente aussi une structure à deux domaines similaire à celle présenté pour la phytase de A. niger. En effet, le domaine a/b est encore une fois conservé, tandis que le domaine a présente de différences importantes(domaine variable). Ainsi, deux hélices a (I, J) se trouvent au centre, avec un ensemble d’hélices autour, à la façon de la phytase de A. niger ; pourtant, la présence d’un uniqueb-hairpin en contournant le bord opposé du site actif dans la poche catalytique a été observée.



Figure 2 : Structure d’E. coli phytase et sa comparaison avec d’autres enzymes. a) La grande poche du site actif divise la protéine en deux domaines : le domaine a/b (bleu), ainsi que le domaine a (rouge). Noter la présence du b-hairpin (feuillets 6 et 7). Les quatres ponts disulfure sont présentés en jaune. b) Structure de la même enzyme mettant en évidence seulement les carbones a . c) Comparaisons entre les structures de (i) phytase de E. coli (ii) phytase de A. niger et (iii) phosphatase acide du rat.


Une autre enzyme appelée "Aspergillus niger pH 2.5 acide phosphatase" a été caractérisé par cristallographie. Cette protéine, hors du commun des autres constituant la famille des histidine phosphatase, présente une structure quaternaire tétramérique en solution, à différence des autres présentés auparavant qui sont des monomères. Ce trétamère est constitué de deux dimères avec une aire de contact d'environ 1600 Å (8 % du total). Les interactions responsables de la tétramérisation provient du côté opposé à l’entrée du site actif, ce qui implique que les quatre entrées sont toujours exposées au solvant, permettant ainsi un accès facile des substrats. De plus, deux résidus N-acéthylglucosamine (NAG472, NAG473) d’un hydrate de carbone sont liés à l’Asn172; ce qui favorise la formation du tétramère (10) .

D’autre part, le dimère est formé par deux monomères qui présente une surface de superposition d'environ 2700 Å (13 % de la surface totale). En effet, dû à cette grande surface de contact, cette interaction a été définie comme une dimérisation. L’interaction principale entre les monomères est observée au niveau des extrémités N-terminale (Résidus 14-24) qui s’étalent sur la surface de l’autre monomère en constituant ainsi le dimère. Le tétramère présente une symétrie 222(D2) et a une structure bipyramidale à basse carrée.



Figure 3 : Diagramme schématique du tétramère de "A. niger phytase pH 2.5 acide phosphatase". L'un des dimères est montré en jaune(A) et bleu (B), tandis que l’autre en rouge (A’) et pourpre (B’). Les hydrates de carbone présents dans l’enzyme sont présentés en blanc. Les extrémités N-terminale responsables de la superposition entre les monomères (A-B) sont montrés en représentation des sphères et bâtonnés. Les sites catalytiques vers l’observateur en cercle plein, et ceux du côté opposé à l’observateur en cercle entrecoupé. Noter que la différence entre A et B est supposé être dû seulement à l’analyse cristallographique.


Noter que la différence réalisée entre les monomère A et B est simplement comme conséquence de l’étude cristallographique, il est donc considéré que tous les monomères sont identiques. En effet, l’analyse d’homologie structurelle des unités monomériques avec la phytase de A. niger a montré une similarité d'environ 50 % entre les deux structures, différence expliquée principalement par les faits suivants (voir les Figures 4 et 5 ci-dessous) :

1 - Les extrémités N-terminale dans les monomères sont utilisées pour former le dimère. Dans le cas de la phytase de A. niger, la présence d’une boucle compact élimine cette possibilité(l’existence du pont disulfure Cys8-Cys17 est responsable de cette fermeture).

2 - L’hélice a « e » est désordonnée, et une longue boucle étirée remplace l’hélice a « f » dans "A. niger pH 2.5 phytase".

3 - L’extrémité C-terminale de "A. niger pH 2.5 phytase" est 16 acides aminés plus longue par rapport à celle de la phytase de A. niger.



Figure 4 : Stéréo diagramme de la structure tridimensionnelle de "A. niger pH 2.5 acide phosphatase". Les deux domaines a/b (en bas) et a ( vers le haut) délimitent la poche catalytique entourée en vert. L’his63 catalytique est en vert, les feuillets b en bleu et les cinq ponts disulfure en jaune.





Figure 5 : Diagramme stéréo de la superposition des structures tridimensionnelles de "A. niger pH 2.5 acide phosphatase" (jaune) et la phytase de A. niger (pourpre).