2. Classification des phytases :

2.1 Les Histidine Phytases :

2.1.2 Le site catalytique :

Comme il a été indiqué auparavant, la poche catalytique se trouve à l’interface des deux domaines. C’est au niveau de cette crevasse que les résidus concernés dans l’hydrolyse du substrat résident. Une comparaison entre le site actif de l’acide phosphatase du rat et celui de la phytase de A. niger a montré l’existence de deux régions spatiales bien définies. D’un côté, les acides aminés conservés Arg58 (Arg11 pour l’acide phosphatase du rat) ; His59 (His12), Gly60 (gly13), Arg62 (Arg15) et Pro64(Pro17) qui constituent en fait le motif RHGxRxP déjà présenté ; ainsi que d’autres comme l’Arg142(Arg79), His338(His257) et Asp339(Asp258).

Tous ces résidus proviennent du domaine a/b ; sauf la Pro64 qui provient du domaine a . Une autre constatation importante vient du fait que bien que ces deux enzymes ne catalysent pas l’hydrolyse du même substrat, le type de liaison à hydrolyser est bien le même ; ce qui implique que les résidus qui interviennent à ce processus doivent être ceux du motif conservé provenant du domaine a /b . Afin de corroborer cette hypothèse, plusieurs études de mutagenèse dirigé au niveau de ces résidus ont constaté la validité du modèle (11).

D’autre part, les résidus provenant du domaine a qui constituent la poche catalytique ne sont pas conservés et une conséquence intéressante de ceci est le fait que la poche catalytique est plus espacée dans le cas de la phytase de A. niger que pour l’acide phosphatase du rat ; dû à la différence de taille des résidus provenant du domaine á . Cette constatation est en accord avec la différence de taille des substrats, ce qui pourrait indiquer que ce sont les résidus du domaine á qui sont impliqués dans la reconnaissance du substrat 6 .

Une étude plus approfondie de l’interaction enzyme substrat a été réalisée pour le cas de E. coli phytase, ceci à travers de la détermination de sa structure cristallographique tant en présence comme en absence de substrat 7 . Une des premières constatations vient du fait que le substrat est lié au site actif par le résidu 3-phosphate. Les interactions électrostatiques observées au niveau de la position 3 du phytate correspondent à la coordination du phosphate avec l’Arg16 et l’Arg20 du motif conservé RHGxRxP, ainsi qu’avec l’Arg92, His303 et Asp304. L’analyse cristallographique a montré aussi que l’His17 est orientée pour l’attaque nucléophile grâce à l’interaction pont hydrogène avec le carbonyle de la Gly18. Ces constatations réalisées pour la phytase de E. coli sont aussi vraies pour la phytase de A. niger et la phosphatase acide du rat. De plus, pour le cas de la phytase de E.coli, l’extrémité N-terminale de l’hélice L est dirigée vers le site actif. Ceci pourrait être aussi impliqué dans la bonne orientation pendant l’entrée du substrat.


Figure 6 : Diagramme schématique des interactions électrostatiques observées au niveau du site actif. Noter la coordination du phosphate en position 3 avec les résidus Arg20, Arg16, Arg92, His303 et Asp304. La bonne orientation du substrat dans le site catalytique provient de la construction « stéréochimique » du site, entre autres la présence du dipôle de l’hélice L se dirigeant vers le site catalytique.


L’étude cristallographique en présence de substrat a montré que la liaison du substrat induit des changements conformationnels près du site actif. Le plus frappant déplacement correspond aux résidus 20 à 25 qui constituent le site actif. La chaîne latérale de l’Arg20 se déplace vers l’arrivée du phosphore en position 3 du phytate afin de constituer la première interaction. De cette façon, le mouvement de la chaîne latérale de 2,98 Å avec un déplacement de 0,85 Å du carbone a, ainsi que d’autres déplacements au niveau de la Thr23 (3,55 Å du carbone a) et Lys24 (4,66 Å) sont responsables de capturer le substrat. D’autre part, avant l’entrée du substrat dans la poche catalytique, la chaîne latérale du Glu219 est dirigée vers le centre du site.

Comme conséquence de l’entrée du substrat, des interactions stériques et répulsives d’origine électrostatique, déplacent ce résidu vers l’Asp325. Ce déplacement du Glu219 coupe l’interaction existante entre ce résidu et l’Asp304 (par l'intermédiaire d’une molécule d’eau qui rend défavorable la déprotonation de ce dernier), ce qui favorise la déprotonation de l’Asp304, en transférant ainsi son proton à l’oxygène sortant pendant l’étape de l’hydrolyse du substrat. De cette façon, le Glu219 agit comme un switch responsable de l’activation de la catalyse.


Figure 7 : Interaction entre le Glu219 et l’Asp304. En absence du substrat, la déprotonation de l’Asp304 est défavorisée par l’interaction, à travers une molécule d’eau, avec le Glu219. A l’entrée du substrat ( phosphate en position quatre mis en évidence en bleu), le déplacement du Glu219 par des répulsions tant électrostatiques comme stériques détruisent cette interaction et la déprotonation du Asp304 via la protonation de l’alcool sortant pendant l’hydrolyse devient viable.


Une étude similaire au niveau de l’homologie du site catalytique de "A. niger pH 2,5 acide phosphatase" avec la phytase de A. niger a été réalisée. En accord au modèle présenté auparavant, les résidus conservés sont aussi présents chez "A. niger pH 2,5 acide phosphatase", avec l’His63 et l’Asp319 comme les résidus nucléophile et donneur de protons respectivement. L’étude de superposition des résidus du site actif de ces deux types d’enzymes a montré certaines différences, provenant théoriquement du pH optimal pour la catalyse, ainsi que la différence de spécificité par le substrat. En effet, "A. niger pH 2,5 acide phosphatase" présente un pH optimal de 2,5 ; à différence avec la phytase de A. niger qui présente deux pHs optimales: 2,5 et 5,0 8 .

Puisque les deux centres catalytiques sont assez similaires, la raison de cette différence de pH optimal provient de la distribution de charges. Le site catalytique de "A. niger pH 2,5 acide phosphatase" présente deux acides aminés acides : Asp75 et Glu272 ; en revanche, la phytase de A. niger présente deux acides aminés acides et quatre basiques : Glu205, Asp239, Lys69, Lys71, Lys227, Lys228. À pH 2,5, les acides aminés acides ne sont pas chargés, alors que les acides aminés basiques le sont positivement, ce qui implique un environnement non répulsif pour le phytate chez "A. niger pH 2,5 acide phosphatase".

En revanche, dans le cas de la phytase de A. niger, l’environnement est plutôt attractif dû aux charges positives présentes. À pH 5,0, les acides aminés acides sont plutôt chargés négativement et les acides aminés basiques sont chargés positivement. Donc, pour l'enzyme "A. niger pH 2,5 acide phosphatase", l’environnement est cette fois-ci répulsif pour le phytate, tandis que pour la phytase de A. niger, il est encore attractif.


Figure 8 : Diagramme stéréo de la superposition des sites actifs de l'enzyme "A. niger pH 2.5 acide phosphatase" (jaune) et de la phytase de A. niger (pourpre). Il est possible de noter la grande conservation structurelle des résidus constituant le site catalytique.



Figure 9 : Représentation de la surface du site actif de l'enzyme "A. niger pH 2.5 acide phosphatase" et de la phytase de A. niger, pour les deux valeurs de pH étudiés. La surface est colorée en fonction du potentiel électrostatique local : rouge (- 10 V) et bleu (+ 20 V). a) "A. niger pH 2.5 acide phosphatase" à pH 2,5. b) "A. niger pH 2.5 acide phosphatase" à pH 5,0. c) phytase de A. niger à pH 2.5 d) phytase de A. niger à pH 5.0. L’apparition de potentiels électrostatiques localement négatifs en (b) (zone en rouge) explique pourquoi l'enzyme "A. niger pH 2.5 acide phosphatase" n’est pas optimalement actif à pH 5,0 (répulsion du phytate )