2. Classification des phytases :

2.1 Les Histidine Phytases :

2.1.3. Caractérisation Biophysique et Biochimique des membres de cette famille :

Bien que d’autres enzymes phopshatases ne présentent pas encore une structure cristallographique résolue, sa classification dans la famille des Histidine phosphatases avec spécificité par le phytate peut être réalisée 12,13 . En effet, la réalisation de différentes analyses, comme la comparaison de séquences primaires avec des phytases déjà caractérisées, la caractérisation du produit final de la réaction, le pH optimal enzymatique, ainsi que des études de mutagenèse dirigée vers le site catalytique ont permis de répertorier d’autres Histidine phytases tant d’origine microbien, ainsi que d’autres organismes (plantes ou même des animaux). De cette façon, une autre enzyme phytase provenant du champignon Aspergillus fumigatus a été caractérisée (14), (15) .

Une caractéristique qui a appelé l’attention, au moins du secteur industriel, est le fait que cette enzyme est capable de maintenir des bons rendements de catalyse même après de traitements à températures élevées (90-100° C) par rapport aux autres membres de cette même famille (12), (16).

A ce point, il existe une divergence entre deux groupes de recherche. Voir chapitre sur la thermostabilité, ainsi que les références (12) et (15). L’étude est réalisée avec des échantillons provenant des champignons; à savoir A. niger, A. terreus, A. fumigatus, Emericella nidulans, Myceliophtora thermophyla, ainsi qu’en comparant toujours avec celui de E. coli.

Cette constatation mesurée par Dichroïsme circulaire peut être conséquence d’un très fort repliement de la protéine pour résister à ces températures, ou bien, sa capacité de reconstituer sa structure tridimensionnelle sans difficulté après dénaturation. Bien sur, cette propriété est très intéressante du point de vue application, sujet qui sera traité plus tard ( voir thermostabilité). Quand la séquence primaire de cette enzyme a été comparée avec celle de la phytase de A. niger, il a été montré une similarité de 66 % ; malgré ceci, elle contient encore le motif conservé caractéristique au niveau du site actif, avec les deux résidus catalytiques Histidine et Aspartate ; ainsi que les dix résidus cystéine responsables des cinq ponts disulfure constituant la structure tertiaire.

D’autre part, elle présente trois sites potentiels pour la glycosylation de plus par rapport à A. niger phytase. Bien qu’elle présente une large gamme de pH pour l’activité catalytique, cette dernière est de 13 % inférieur par rapport à la phytase de A. niger, avec une valeur de Kcat. significativement plus bas mais avec un Km. similaire. De plus, l’introduction d’un pseudo-substrat (myo-inositol hexasulfate) a montré l’inhibition quasi complète de l’activité ; résultat similaire à celui observé pour la phytase de A. niger, ce qui indique une forte homologie au niveau de la géométrie et l’accessibilité au niveau du site actif. Deux autres membres de cette famille ont été observé chez Aspergillus terreus et Myceliophthora thermophila (4). En se basant sur l’homologie des séquences protéiques (47-60 %), ainsi que en leurs caractéristiques enzymatiques, ces deux nouvelles phosphatases peuvent être aussi classées dans la famille des Histidine phytases 6.

Une étude de caractérisation Biochimique de plusieurs phytases provenant des champignons (fungi phytases)17 a montré que malgré la similitude de séquences parmi ces enzymes, elles présentent de propriétés catalytiques différentes. Ainsi par exemple, le pH optimal obtenu avec le même substrat variait entre 2,5 à 7,0 et les marges de pH pour chaque enzyme étaient très hétérogènes (c.f. pH 4-7,3 pour la phytase de A. fumigatus, ou pH 6,5 pour E. nidulans).

Des différences très marquées au niveau de la spécificité du substrat ont été aussi observées, non seulement avec des différents myo-inositolphosphates mais aussi avec d’autre substrats classiques des acides phosphatases.


Tableau 1 : Activité spécifique et valeurs de Km pour les acide fungal phytases. a La valeur en parenthèse correspond au nombre de préparations réalisées. Cette table a été prise de la référence (16).

Un excès de phytases par rapport au substrat a montré que le produit final est le même pour tous les échantillons, à savoir le myo-inositol-2-monophosphate. Ceci a démontré que toutes ces enzymes ont une préférence pour le clivage des liaisons en position équatoriale, ce qui en aucun cas veut dire que le mécanisme de déphosphorylation à suivre soit le même pour toutes les enzymes. En tout cas, pour le moment seulement les phytases provenant des plantes et de E.coli hydrolysent en premier le phosphate en position 6, tandis que les fulgal phytases hydrolysent plutôt le phosphate en position 3 en premier étape. D’autre part, il a été observé une différence au niveau de la spécificité du substrat. En effet, A. fumigatus, E. nidulans, M. thermophyla expriment des phytases avec une large marge de spécificité; tandis que les phytases de A. niger, A. terreus ainsi que E. coli présentent une grande spécificité par le phytate.

Une étude similaire avec le même groupe de phytases indiqué a été réalisée, cette fois-ci afin de les caractériser au niveau de leur masse relative, les possibles glycosylations ainsi que leur résistance à la protéolyse. En effet, une comparaison des tailles moléculaires obtenues par centrifugation analytique, chromatographie sur gel perméable, spectroscopie de masse, SDS-PAGE, ainsi que par analyse de séquences a montré clairement que toutes les fungi-phytases considérées, de même que pour E. coli phytase, sont des monomères. D’autre part, le pourcentage de glycosylation de ces différentes phytases est assez variable, tant en fonction des sites potentiels pour la glycosylation, ainsi qu’en fonction de l’hôte utilisée pour son expression. Un point intéressant ici, est que si bien la glycosylation peut être très variable pour une même phytase, ceci n’a pas des implications sur son activité catalytique, non plus sur sa thermostabilité.

Finalement, certaines phytases étudiées ont montré une tendance à subir des attaques de protéases au niveau des boucles exposées au solvant. Les résidus capables de subir la protéolyse ont été identifiés et des expériences de mutagenèse dirigée ont pu montrer qu’il est possible de surmonter ce problème sans modifier les propriétés enzymatiques (18).


Figure 10 : Conformation la plus favorable énergiquement de l’acide phytique. Noter que le phosphate en position deux se trouve en configuration axial, tandis que les autres en équatorial. De cette façon, la position 2 est la dernière en être déphosphoryée par les fungi phytases.



Tableau 2 : Taille moléculaire des phytases fongiques et de E. coli déterminées expérimentalement à travers des différentes techniques indiquées. ^a Ces protéines ont été exprimées dans H. polymorpha ; Toutes les autres phytases fongiques ont été exprimées dans A. niger. ^b Le numéro en parenthèse correspond au nombre de préparations examinées. ^c ND, non déterminée à cause de limites d’appareillage. Ce tableau a été pris de la référence (17).


Noter que toutes les enzymes traitées proviennent des micro-organismes; par contre il existe des organismes plus développés qui sont aussi capables d’exprimer ce type d’enzymes. Tel est le cas de la présence de phytases dans le grains de maïs, juste pour citer un des exemples, afin de libérer le phosphate gardé sous forme de phytate à son intérieur (19) .

Ce type d’enzymes, bien qu’elle présente les caractéristiques d’une Histidine phytase (site catalytique HD avec motif conservé RHGxRxP et pHs optimales acides), des variantes assez intéressantes sont trouvées au niveau de sa conception. Juste pour citer un exemple, la présence d’une grande séquence hydrophobe suggère la possible fixation de cette protéine au niveau de la membrane interne de la cellule, fait complètement inusuel chez les autres phytases étudiées.



Figure 11 : Analyse de la dégradation du phytate par HPLC. (A) A. fumigatus phytase. (B) E. nidulans phytase. (C) M. thermophyla phytase. (D) phytase de A. niger. (E) A. terreus phytase. (F) E coli phytase.