2. Classification des phytases :

2.2 Phytases métallo-dépendantes :

Ce deuxième groupe de phytases ; identifiées grâce à leur manque de similarité de séquences, même au niveau du motif conservé RHGxRxP caractéristique des His. Phytases, est constitué dans la plupart par des enzymes d’origine bactérienne, tel est le cas de celles produits par Bacillus subtilis (20), ainsi que celles exprimées par le Bacillus amyloliquefaciens (21). En effet, une analyse de similarité de leurs 383 acide aminés a donné un résultat de 93 % de similitude. Une caractéristique intéressante de cette famille est leur dépendance pour les ions calcium au niveau de sa stabilité ainsi que de son activité catalytique.

Afin de mettre en évidence le rôle des ions calcium dans la stabilité de l’enzyme ainsi que de connaître la structure détaillée de celle-ci, des études cristallographiques ont aboutit à l’obtention de la structure cristalline des phytases thermostables (Ts-phy) provenant de Bacillus amyloliquefaciens à 2.1 Å de résolution (22) .


2.2.1 Structure de l’enzyme :

La structure de l’enzyme dépourvue de la séquence signal (la séquence signal correspond aux premiers 28 acides aminés. La structure de la protéine est évaluée entre les acides aminés 29 à 383.) a la forme d’une hélice à six ailes. Chaque aile est composée de quatre à cinq feuillets plissés b qui sont interconnectés entre eux d’une façon topologiquement identique. Le quatrième feuillet de chaque aile est toujours connecté au premier de l’aile suivante. Les six ailes sont alignées au niveau des axes de l’hélice, dont le centre est constitué d’un canal la traversant d’un côté à l’autre. De plus, les différentes ailes présentent des interactions de caractère hydrophobe entre elles.


Figure 12 : a) Diagramme en ruban et b) Repliement topologique de Ts-Phy. La structure présentée corresponde aux résidus 29-381 du total de 383. Les premiers 28 résidus correspondent à la séquence signal. Chaque aile est montré en différentes couleurs, Ca1, Ca2 et Ca3 sont les ions fixés aux sites de plus grande affinité. Ca3 occupe le centre de la molécule. Ca4,Ca5 et Ca6 sont les ions fixés au site catalytique de l’enzyme. acides aminés 29 à 383.


Une analyse de similarité de structures a donné de bons résultats par rapport à la neuraminidase du virus influenza, quino-proteinglucose deshydrogenase (GDH) ainsi qu’avec la nitrile reductase. Par contre, cette analyse n’a pas montré d’homologies avec d’autres enzymes phosphatases existantes. Au niveau de l’extrémité supérieure, la molécule présente une crevasse pas trop profonde, tandis que du côté opposé elle semble être plate.

La fixation des ions calcium est réalisée aux trois endroits de la molécule, deux à la périphérie, tandis que l’autre juste au centre de celle-ci. Ces trois sites correspondent aux sites de forte affinité pour ces ions ; en contraste avec des autres trois ions calcium qui sont fixés aux sites dit de faible affinité. Les deux ions calcium se trouvant à la périphérie de la molécule, Ca1 et Ca2, forment un centre à deux atomes dont l'Asp308 sert comme résidu connecteur.

Le Ca1 est heptacoordiné par les résidus Glu43, Asp308, Aps341 (par leurs groupements carboxylates), Asn339, Ile340 (carbonyles de la chaîne latérale) ainsi que par une molécule d’eau. Le Ca2 est hexacoordiné par l’Asp308,Asn336,Gly309,Glu338 ainsi que par deux molécules d’eau. Ces ions semblent être responsables de maintenir la structure circulaire très serrée de la molécule. Le Ca3, se trouvant au milieu de la molécule, est coordiné par l’Asp56, Pro57(carbonyle) et Val101, ainsi que par trois molécules d’eau, lesquelles sont à leur tour liées à l’ensemble par des liaisons hydrogènes provenant du site entier.




Figure 13 : Sites de forte affinité pour le calcium.
Représentation des coordinations des Ca1 et Ca2 dans les sites de forte affinité.