3. Applications et environnement :

Comme il a été indiqué pendant l’introduction, l’acide phytique est la plus grande forme de stockage de phosphore dans les céréales, le pollen, les légumes et autres végétaux. Sous sa forme basique, il est considéré comme un facteur antinutritionnel à cause de sa capacité de chélater des minéraux, comme le magnésium, le zinc, et le calcium (23) , ainsi que ses possibles interactions avec de protéines, ce qui diminue l’absorption de ces composants importants pour la nutrition des organismes. L’utilisation de phytases comme un additif alimentaire a été examiné plusieurs fois dans les vingt dernières années ; ceci afin de transformer le phytate en une source potentiel active de phosphore inorganique. Pourtant, les prix élevés de l’enzyme, comparés au prix du phosphore d’origine inorganique ont bloqué ceci pendant des années.

Récemment, cet intérêt est réapparu dû au fait que la production des enzymes est devenue très bon marché grâce à la technologie de l’ADN recombinant. De plus, l’augmentation de la conscience écologique dans la planète a aussi poussé à considérer plusieurs voix possibles pour diminuer la pollution par excès de phosphore dans les déchets des animaux incapables d’utiliser le phytate comme source de phosphore.


3.1 Le problème de la thermostabilité :

Le fait de considérer les phytases comme additif alimentaire dans la fabrication de la nourriture des animaux monogastriques d’élevage, a toute une série d’implications, entre autres, le fait que l’enzyme doit être capable de résister aux hautes températures appliquées pendant la fabrication des aliments( 60-90°C). Pourtant, la plupart des phytases connues présentent des températures de dénaturation entre 56-63°C. Alors, un des premiers objectifs de la recherche appliquée dans ce domaine, consiste à rendre ces enzymes capables de rester dans sa structure native même à ces températures. L’augmentation de la thermostabilité d’une enzyme requiert usuellement le remplacement de certains acides aminés, tout en gardant la même structure (24) (25) .

Le problème principal de ceci, réside dans le fait de repérer ces acides aminés. En termes généraux, les mutations appliquées doivent viser l’augmentation des interactions ponts hydrogène, l’apparition de nouveaux ponts disulfure, l’augmentation de la stabilité des hélices a, les feuillets ou coudes b, ainsi que les boucles flexibles présentes dans l’enzyme. Malgré ces connaissances au niveau de la stabilité des protéines, une vraie expérience implique la réalisation de plusieurs mutations, suivies d’une sélection des bons échantillons pour recommencer le processus.

Trois approches différents sont souvent appliquées pour augmenter la température de dénaturation d’une protéine donnée :

- Mutagenèse aléatoire suivie de la sélection.

- Comparaison de la séquence des acides aminés avec une autre protéine présentant une plus grande thermostabilité, puis mutagenèse dirigée vers les acides aminés sélectionnés.

- Introduction des possibles acides aminés stabilisateurs, basée en la structure tridimensionnelle de la protéine.

Chacune de ces approches a été appliquées avec succès sur plusieurs exemples de protéines connues. Jusqu’aujourd’hui treize phytases provenant de six différents espèces de champignons ont été publiés. Malgré le fait que parmi les organismes choisies pour son isolation, certains ont été choisis afin d’améliorer les chances de trouver des phytases thermostables, toutes perdent sa structure native entre 56-63° C.


Tableau 3 : Thermostabilité des phytases La température optimale pour l’activité enzymatique ainsi que celle pour la dénaturation (Tm) a été déterminée par DSC. ND : non déterminée.


Dans cette classification, seulement la phytase de A. fumigatus arrive à récupérer sa structure native après le traitement à des températures au dessus de sa température de dénaturation. Pour les autres enzymes, le chauffage au-dessus de la température de dénaturation provoque la perte irréversible, tant de la structure native que de l’activité enzymatique (26), (27) .

Lehmann et Al. ont réalisé la construction d’une phytase consensus avec une très grande résistance thermique basées en la comparaison de séquences avec les différentes fungal phytases étudiées. La phytase consensus obtenue avait entre 58,3 à 80 % d’homologie de séquence avec les phytases de base. Elle présentait des propriétés catalytiques semblables avec les autres enzymes, par contre sa température optimale avait été augmentée de 16-26° C, de même que pour sa température de dénaturation (15-22°C). La comparaison de la structure tridimensionnelle de la phytase consensus avec la phytase de A. niger, montre que la stabilisation d’une boucle à la surface, ainsi que de l’extrémité N-terminale sont les paramètres principaux responsables de l’augmentation de la température de dénaturation.

De la même façon que pour les phytases fongiques, des études de mutagenèse dirigée ont été effectuées sur la phytase de E. coli et ont montré qu’il est possible d’améliorer tant l’efficacité catalytique, ainsi que sa thermostabilité (28) .

En effet, l’introduction des sites potentiels additionnels pour la N-glycosylation, ainsi que l’expression dans une hôte comme Pichia pastoris implique une augmentation de la thermostabilité de l’enzyme dû à la présence de plusieurs groupes glucose ajoutés post-traductionnellement sur la protéine. Finalement, ces exemples montrent qu’il est possible d’appliquer cette approche dans la construction d’autres enzymes afin d’augmenter leur thermostabilité tout en maintenant les propriétés catalytiques.