I-2 EVOLUTION DE LA NOTION DE TRANSDUCTION DU SIGNAL DES RCPG : D'UN MENAGE À TROIS À UN MENAGE À QUATRE PARTENAIRES.
Il y a encore trois ans, la transduction du signal des RCPG impliquait trois partenaires, les RCPG les protéines-G et les effecteurs. Ce modèle, l'un des plus heuristiques de la biologie cellulaire de ces vingt dernières années est resté très longtemps inchangé.

I-21 Le modèle à trois partenaires :
C'est en 1970 que l'équipe de Martin Rodbell découvrit le rôle majeur du GTP et des protéines liant le GTP (Protéines-G) dans les processus de la communication cellulaire. L'observation de la stimulation de l'adénylyl-cyclase hépatique par le glucagon en présence de faibles concentrations de GTP (Rodbell et al., 1971) lui permit d'établir deux concepts majeurs qui lui valurent de partager avec Alfred Gilman, en 1994, le prix Nobel de physiologie. Le premier concept était que le premier partenaire, le récepteur, lie spécifiquement l'agoniste et stimule le deuxième partenaire, le transducteur, qui ne peut être activé qu'en présence de GTP. Le transducteur, à son tour, active le troisième partenaire, l'effecteur. Le deuxième concept était que le transducteur liant le GTP est une GTPase, des analogues non hydrolysables du GTP stimulant l'effecteur en absence d'activation du récepteur.

Figure 9

Depuis la découverte de Rodbell, les trois partenaires ont été purifiés, leurs gènes isolés, leurs mécanismes d'interaction analysés et aujourd'hui, l'étude de leur structure tridimensionnelle est en progrès constant. Ainsi, la purification des protéines-G par le laboratoire d'Alfred Gilman (pour revue : Gilman, 1987), de même que la détermination de leur structure cristallographique (Wall et al., 1995 - Lambright et al., 1996) ont révélé que ce sont des hétérotrimères composés de trois sous-unités (Ga, Gbb, Gg) fortement associées dans leur état inactif (état-1) (figure 9A). La sous-unités Ga lie alors une molécule de GDP et les sous-unités Gbg sont indissociables sauf en milieu dénaturant. Les RCPG ont pour unique rôle de stimuler la libération du GDP agissant comme des protéines d'échange (GRF : GDP releasing factor). A l'inverse, la liaison de Gbg retarde l'échange nucléotidique. Les rôles du récepteur et de Gbg sont donc identiques aux facteurs d'échange GDS (guanine nucleotide dissociation stimulator) et GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitor) des petites protéines-G de type Ras. L'état-2 est caractérisé par l'absence de nucléotide au sein de la sous-unité Ga (figure 9A). Le récepteur est alors fortement associé à la protéine-G (Chabre et Deterre, 1987) et présente souvent une meilleure affinité pour l'agoniste (état-1 et -3). L'état-2 est extrêment transitoire, le GTP s'associant très rapidement à la sous-unité Ga vidée de son nucléotide. Il se produit alors une dissociation des partenaires, Ga-GTP d'une part et Gbg d'autre part, chacun s'associant à des effecteurs intracellulaires pour en modifier l'activité (état-3) (pour rappel : figure 1). L'hydrolyse du GTP met fin à l'interaction de Ga-GTP avec son effecteur. Ga se réassocie avec Gbg, ce qui met fin à l'interaction de Gbg avec son propre effecteur (figure 9A). La cinétique gouvernant l'activité de Gbg est réglée par celle de Ga.

I-22 Le modèle à quatre partenaires :
Depuis très longtemps, il avait été remarqué que l'hydrolyse spontanée du GTP, au sein des Ga-GTP purifiées, était trop lente pour rendre compte des vitesses de désactivation de leurs effecteurs. En 1995, De Vries et al. mettaient en évidence un quatrième partenaire en identifiant, par la méthode du double hybride, une protéine qui s'associait à Gai-3 nommée GAIP (Ga interacting protein) (De Vries et al., 1995). GAIP est un des membres d'une nouvelle famille de protéines dites protéines RGS (Regulator of G protein signaling) qui comporte plus de 25 membres chez les mammifères ayant tous un domaine central de 130 résidus bien conservé (domaine RGS) responsable de l'interaction avec les sous-unités Ga (tableau 2). La classification des protéines RGS, basée sur l'analyse phylogénétique permet de définir six familles (tableau 2) (Zheng et al., 1999).

Les protéines RGS agissent comme des régulateurs négatifs de la signalisation protéines-G dépendante en accélérant l'activité GTPasique des sous-unités Ga (passage de l'état-3 à l'état-1) (figure 9A). Leur rôle est donc analogue aux protéines GAP (GTPase-activating protein) intervenant dans le cycle d'inactivation des petites protéines-G de type Ras (figure 9B) (pour revue : Dohlman et Thorner, 1997). Les protéines RGS accélèrent de 100 à 1000 fois l'hydrolyse du GTP des sous-unités Ga et présentent une spécificité d'action vis à vis de celles-ci. Par exemple, les RGS les mieux caractérisées (RGS1 et RGS4) fonctionnent comme des activateurs de l'activité GTPasique des sous-unités Gi, Go, Gz, Gt et Gq mais n'ont aucune activité sur les sous-unités Gs et G12 (tableau 2). Les résultats de co-cristallisation entre RGS4 et la protéine Gia1 révèlent que les RGS augmentent l'activité catalytique de Ga en stabilisant l'état de transition (Tesmer et al., 1997).

Figure 10

La régulation de la concentration des protéines RGS, au cours du développement ou chez l'adulte, leur distribution spatiale ainsi que leur spécificité d'action ouvrent la voie à une modulation de l'intensité des effets physiologiques des RCPG par ce quatrième partenaire de la transduction. Dans ce contexte, l'implication des protéines RGS a déjà été rapportée dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires telles que la prolifération et la différenciation cellulaire, le développement embryonnaire, la réponse aux neurotransmetteurs ou encore dans le trafic membranaire (De Vries et Gist Farquhar, 1999). Cette famille de protéines est définie par son domaine RGS qui lie les sous-unités Ga et est responsable de l'activité GTPasique. Cependant, il existe des motifs additionnels dans les régions N- et C-terminales entourant le domaine central qui prédisent l'interaction avec d'autres protéines (figure 10).

Figure 11

La première indication démontrant que les protéines RGS ne sont pas justes des GTPases est venue d'une étude électrophysiologique. In vivo, l'activation des RGS atténue le signal physiologique ou accélère sa désactivation. C'est le cas du canal potassique de type GIRK régulé par les récepteurs muscariniques via Gbg et dont la désactivation est augmentée de 20 à 40 fois par RGS1, 3, 4 mais pas par RGS2 (Doupnik et al., 1997). Plus surprenant, la vitesse d'ouverture du canal GIRK, par les récepteurs muscariniques, est accélérée par les RGS. Les RGS ont donc, en plus de leur rôle de GAP, un rôle dans l'activation de l'échange GDP/GTP ou dans la dissociation entre Ga et Gbg (Zerangue et Jan, 1998) (figure 11).

Depuis cette étude, les protéines associées ainsi que les fonctions attribuées aux protéines RGS n'ont fait que croître (Hepler, 1999 - De Vries et Gist Farquhar, 1999). Pour ne citer que quelques exemples :

Figure 12

- GAIP est présente au niveau des vésicules tapissées de clathrine et peut interagir avec le domaine PDZ de GIPC (GAIP interacting protein C-terminus) grâce au motif SSEA situé dans la région C-terminale. La localisation vésiculaire de ces deux protéines suggère la participation de ces protéines à la désensibilisation des RCPG et à la régulation du transport vésiculaire (figure 12A).

- P115RhoGEF possède un domaine RGS qui agit comme GTPase pour Ga13 et un domaine DH (dbl homology) qui sert de facteur d'échange GDP-GTP pour la GTPase RhoA. Ce mécanisme, initié par l'activation de la sous-unité Ga13 par le récepteur thrombine provoque des réarrangements morphologiques du cytosquelette (figure 12B).

- RGS12 accélère l'hydrolyse du GTP des sous-unités Gai et probablement Ga12/Ga13. L'analyse structurale de la protéine RGS12 révèle la présence d'un domaine PDZ capable d'interagir avec la séquence C-terminale STTL du récepteur de l'interleukine-8 sous-type B (IL-8B) (figure 12C).

- La famille C des protéines régulatrices du signal possède un domaine N-terminal DEP (dishevelled, Egl-10, pleckstrin) et un nouveau domaine nommé GGL (G-protein gamma like). Le domaine DEP contribue à la localisation membranaire des protéines RGS. Le domaine GGL, dont l'homologie avec les sous-unités Gg est forte, permet l'association à l'isoforme b5 des protéines-G (Gb5). La signification physiologique de cette interaction protéine-protéine n'est pas connu (figure 12D).

- La famille E (axine et conductine) intervient dans la cascade des récepteurs de type "Frizzled" (fz) impliqués dans le développement embryonnaire et la polarité cellulaire. En l'absence de l'agoniste, appelé "wingless" chez la drosophile et Wnt-1 chez les vertébrés, un complexe quaternaire est formé entre la protéine RGS, la GSK3 (glycogen synthase kinase), l'APC (adenomatous polyposis) et la b-catenine. La reconnaissance de l'APC par l'axine se fait par le domaine RGS. La phosphorylation de la b-catenine et de l'APC par la GSK3 permet la dégradation de la b-catenine. Le rôle des protéines RGS (axine ou conductine) est de stabiliser la formation de ce complexe. En présence de l'agoniste, le récepteur fz, après avoir stimulé une protéine G de type Gi/Go couplée à la phospholipase C modifie d'une manière inconnue une protéine hyperphosphorylée, "dishevelled"(Dsh). Cela induit l'inhibition de GSK3. Le complexe quaternaire est alors déstabilisé, d'une part par la non phosphorylation de l'APC et de la b-catenine par GSK3, et d'autre part par la compétition existant entre l'APC et les protéines-G activées pour la liaison au domaine RGS de l'axine. La b-catenine alors moins dégradée devient un facteur de transcription capable de réguler des gènes stimulant la division cellulaire (figure 12E).

Malgré des progrès constants, bien des aspects de ce modèle à quatre partenaires restent à découvrir. Comment les ligands modifient-ils la structure des domaines intracellulaires (boucle i2 ou i3) des RCPG notamment lorsque le site de liaison est localisé au niveau du domaine amino-terminal externe ? Comment ces boucles internes se lient-elles aux protéines-G et catalysent-elles l'échange GDP-GTP ? Comment la cinétique gouvernant l'activité effectrice de Gbg est-elle réglée par celle de Ga ? Quelle est la signification physiologique de l'homo- et l'hétérodimérisation ?

L'établissement d'un schéma intégré et dynamique des réseaux de communication formés par l'ensemble des acteurs : récepteurs, protéines-G, effecteurs et autres protéines d'interaction, comme les protéines RGS, est donc devenu maintenant un chapitre essentiel de la physiologie et de la pathologie (voir chapitre II-5).