II-2 DESENSIBILISATION DES RCPG :
Le second niveau d'arrêt du signal affecte le récepteur. Cette inactivation est la conséquence de la phosphorylation du récepteur par deux classes de protéines kinases, la famille des sérine/thréonine kinases appelée aussi "G-protein receptor kinases" (GRK) et la famille des phosphorylases activées par les seconds messagers (protéine kinase C (PKC) et protéine kinase A (PKA)). Dès lors, deux formes de désensibilisation peuvent être distinguées :

II-21 Phosphorylation des RCPG par les kinases couplées aux protéines-G : désensibilisation homologue :

La phosphorylation des RCPG par les GRK est initiée uniquement après liaison spécifique du ligand à son récepteur. Ce découplage fonctionnel, médié par cette famille de sérine/thréonine kinases, est qualifié de ligand-dépendant. On parle alors de désensibilisation homologue. Cet arrêt du signal nécessite la présence d'une classe de protéines solubles, les arrestines, fonctionnant comme cofacteurs des GRK.

II-211 La famille des GRK :

- Structure et activité catalytique des GRK :


Tableau 3

A ce jour, six membres de cette famille ont été identifiés : GRK1 (ou rhodopsine kinase), GRK2 (ou b-adrenergic receptor kinase-1), GRK3 (ou b-adrenergic receptor kinase-2), GRK4 (ou IT-11), GRK5 et GRK6. GRK4 est le seul membre de cette famille à présenter quatre variants d'épissage (Premont et al, 1996). A l'exception de GRK1 et GRK4, localisées respectivement dans la rétine et les testicules, les GRK s'expriment de manière ubiquitaire (Krupnick et Benovic, 1998) (tableau 3).



Figure 15

L'organisation structurale de ces protéines peut être divisée en trois domaines fonctionnels : le domaine N-terminal impliqué dans la reconnaissance du substrat, le corps central responsable de l'activité catalytique et la région C-terminale hypervariable importante pour la translocation des GRK du cytoplasme vers la membrane (Ferguson et Caron, 1998) (figure 15).

Les GRK peuvent phosphoryler les RCPG activés sur les résidus sérine et thréonine contenus dans la queue C-terminale (rhodopsine, récepteur b₂-adrénergique, récepteur somatostatine de type 3) ou dans la troisième boucle intracellulaire du récepteur (récepteur muscarinique à l'acétylcholine M2, récepteur a_2A--adrénergique) (Bünemann et al., 1999). Cependant, contrairement aux phosphorylases activées par les seconds messagers, aucune séquence consensus n'a pu être identifiée sur les récepteurs cibles. Les seules indications permettant de supposer l'existence de sites consensus de phosphorylation concernent les séquences adjacentes aux résidus sérine et thréonine phosphorylés ; GRK1 et GRK2 préférant un environnement constitué de résidus acides à un milieu formé de résidus basiques pour GRK5 et GRK6 (Pitcher et al, 1998a). De récentes observations avancent également que la phosphorylation d'un récepteur donné est variable selon la nature du stimulus et selon le type cellulaire étudié.

La cinétique de phosphorylation des RCPG par les GRK est rapide (T_1/2 = 15 sec) et peut encore être accélérée dans le cas de certains récepteurs tels que les récepteurs olfactifs désensibilisés par GRK3 dans les cellules neuronales (T_1/2 = 200 msec) (Ferguson et Caron, 1998).

- Régulation des GRK :
Le mécanisme, par lequel le récepteur est reconnu et phosphorylé par les GRK, a longtemps été décrit de la manière suivante : L'occupation d'un RCPG par l'agoniste spécifique entraîne le changement conformationnel du récepteur et les régions exposées du récepteur activé sont ensuite phosphorylées par les GRK. Ce modèle simplifié d'interaction entre les GRK et les RCPG a très rapidement été abandonné en raison de la complexité structurale des GRK, de la variabilité des domaines d'interaction avec la membrane plasmique et de l'existence de multiples facteurs de régulation.

Les GRK doivent être présentes au niveau de la membrane plasmique pour médier la désensibilisation des RCPG. Les mécanismes par lesquels les GRK cytosoliques sont transloquées à la membrane cellulaire après activation du récepteur varient d'une kinase à l'autre : farnésylation de la cystéine du motif C-terminal CAAX (GRK1), liaison aux phospholipides membranaires chargés négativement (PIP ou PIP2) et interaction du domaine PH (Pleckstrin homology domain) avec les sous-unités Gbg des protéines-G (GRK2 et GRK3), palmitoylation de résidus cystéines C-terminaux (GRK4 et GRK6), interaction électrostatique entre la région polybasique C-terminale et les phospholipides membranaires (GRK5) (tableau 3) (figure 16) (Penn et Benovic, 1998). Il est à noter que contrairement à GRK1, 2 et 3, les kinases GRK4, 5 et 6 peuvent être associées à la membrane en l'absence d'activation par l'agoniste (Krupnick et Benovic, 1998).

L'activité kinase des GRK peut être modulée par d'autres protéines intracellulaires. Parmi les protéines capables de lier le Ca++, la calmoduline lie et régule négativement GRK2, 5 et 6 (Pronin et al., 1997). A l'inverse, la recoverine inhibe spécifiquement GRK1 en empêchant l'interaction de GRK1 avec le récepteur activé (Chen et al., 1995). GRK2 et GRK5 sont aussi substrats de la protéine kinase C. Les conséquences fonctionnelles de la phosphorylation de ces deux enzymes sont diffèrentes : GRK2 est rapidement activée par la PKC (Chuang et al., 1995) alors que l'activité enzymatique de GRK5 est fortement réduite (Pronin et Benovic, 1997). GRK1 et GRK5 sont également régulées par un mécanisme d'autophosphorylation. L'autophosphorylation de GRK5 stimule son interaction avec le récepteur activé alors que celle de GRK1 facilite sa dissociation après phosphorylation du récepteur (Pitcher et al., 1998a) (figure 16).

- Spécificité des GRK :


Tableau 4

Face à la diversité des récepteurs couplés aux protéines-G, une question intéressante concerne la spécificité de régulation des RCPG par les six membres de la famille des GRK. La localisation restreinte de GRK1 dans la rétine et GRK4 dans les testicules contribue certainement à leurs spécificités. Par contre, la distribution diffuse des autres GRK et le nombre important de facteurs régulateurs compliquent l'identification d'une interaction spécifique RCPG-GRK. Par exemple, GRK2, 3 et 5 peuvent désensibiliser de manière équivalente le récepteur muscarinique M2, le récepteur b2-adrénergique et le récepteur angiotensine II type 1A (tableau 4). Quelques RCPG semblent cependant être phosphorylés sélectivement par certaines GRK. Le récepteur purinergique A3 et le récepteur bradykinine B2 sont préférentiellement désensibilisés par GRK2. De même, le récepteur thrombine et les récepteurs olfactifs sont spécifiquement phosphorylés par GRK3 (Bünemann et Hosey, 1999) (tableau 4).



Figure 16

La plupart des informations sur les GRK a été obtenue par les dosages réalisés in vitro en utilisant des molécules recombinantes et purifiées et par la caractérisation en systèmes d'expression hétérologue. La confirmation du rôle joué par les GRK dans la désensibilisation des RCPG est venue des études effectuées sur les souris transgéniques et "knockout" ainsi que par l'utilisation de la stratégie antisens. Il a ainsi pu être montré que la surexpression de GRK2 et GRK5 au niveau cardiaque réduit considérablement l'activité du récepteur b2-adrénergique (Koch et al., 1995 - Rockman et al., 1996). De même, l'inactivation du gène de GRK3 par recombinaison homologue valide les observations obtenues in vitro concernant l'importance de cette kinase dans la régulation des récepteurs olfactifs présents au niveau de l'organe voméronasal (Peppel et al., 1997). Les souris "knockout" GRK2 -/- sont létales. Ce résultat surprenant démontre que GRK2 est indispensable dans les premiers stades du développement embryonnaire (Jaber et al., 1996) (tableau 4).

Finalement, l'approche antisens a permis de confirmer le rôle de GRK2 dans la désensibilisation du récepteur b2-adrénergique (Shih et Malbon, 1994) et histaminique H2 (Nakata et al., 1996) ainsi que l'implication de GRK5 dans l'inactivation du récepteur thyrotropine (Nagayama et al., 1996) (tableau 4).

- Autres fonctions des GRK :
Récemment, plusieurs groupes ont découvert que GRK2 et GRK5 lient et phosphorylent la tubuline (Carman et al., 1998 - Haga et al., 1998 - Pitcher et al., 1998b). La conséquence physiologique de cette interaction n'est pas connue mais la présence de la tubuline au niveau des microtubules permet de spéculer sur un rôle possible des RCPG dans les réarrangements du cytosquelette.

Un domaine homologue aux protéines RGS a pu être localisé dans le domaine N-terminal des GRK (Berman et Gilman, 1998). Sachant que les protéines RGS peuvent accélérer la vitesse d'hydrolyse de Ga-GTP (voir chapitre I-22), il est possible d'envisager que les GRK peuvent moduler l'activité des protéines-G. Aucune expérience n'est venue infirmer ou confirmer cette hypothèse. La méthode du double hybride a permis d'isoler une nouvelle protéine GIT1 (GRK-interacting protein) capable d'interagir avec les GRK2, 3, 5 et 6. La surexpression de cette protéine augmente la vitesse de phosphorylation des récepteurs b2-adrénergiques par GRK2 et par conséquent cause le découplage récepteur-protéine-G (Premont et al., 1998). GIT1 semble également inhiber l'endocytose et la resensibilisation de ces récepteurs (Premont et al., 1998).

II-212 La famille des arrestines :

- Structure et propriétés des arrestines :


Figure 17

Dans les conditions physiologiques, la phosphorylation par les GRK n'est pas suffisante pour inactiver totalement le récepteur mais requiert la présence de molécules adaptatrices capables d'inhiber définitivement la transduction du signal. Les arrestines constituent une famille de protéines solubles capables d'empêcher l'interaction récepteur-protéine-G en agissant comme cofacteurs des GRK.



Tableau 5

A ce jour, six membres de la famille des arrestines ont été identifiés et divisés en quatre sous-groupes en fonction de l'homologie de séquence et de la distribution tissulaire : (1) l'arrestine visuelle (ou antigène S) des cellules en batônnet découverte de par sa liaison à la rhodopsine (Kuhn et al., 1984). (2) la b-arrestine (aussi appelé b-arrestine-1 et arrestine 2) et la b-arrestine-2 (ou arrestine 3) nommées ainsi pour leur rôle dans la désensibilisation du récepteur b2-adrénergique (Lohse et al., 1990a - Attramadal et al., 1992). Ces deux protéines sont exprimées de manière ubiquitaire avec cependant une concentration accrue dans les tissus lymphatiques. (3) l'arrestine-C (ou arrestine 4 et arrestine-X) des cellules en cône (Murakami et al., 1993 - Craft et al., 1994). (4) l'arrestine-D et l'arrestine-E (séquences encore partielles) ne sont pas caractérisées mais montrent une distribution tissulaire diffuse (Craft et al., 1994 - Ferguson et Caron, 1998). De plus, des variants d'épissage sont connus pour les arrestines-1, -2 et -3 (voir tableau 5).

L'organisation structurale de ces protéines peut être divisée en plusieurs domaines fonctionnels (figure 17). La reconnaissance de l'état de phosphorylation du récepteur par les arrestines s'effectue par le domaine P (phosphorylation-recognition domain) alors que la reconnaissance de la forme activée du récepteur est médiée par l'interaction entre les boucles i1 et i3 du récepteur et le domaine A (activation-recognition domain) des arrestines. Ces deux régions prises indépendamment confèrent une faible affinité des arrestines pour le récepteur-substrat. Par contre, la liaison simultanée des arrestines, via les domaines A et P, au récepteur activé par l'agoniste et phosphorylé induit des changements conformationnels au sein même de la structure des arrestines. Ce réarrangement structural des arrestines démasque un site secondaire S (arrestin hydrophobic domain) de liaison au récepteur et autorise l'interaction entre les domaines régulateurs amino-terminal basique (R1) et carboxy-terminal acide (R2) (figure 17). Ces modifications intramoléculaires ont pour conséquence d'augmenter l'affinité de liaison des arrestines pour le récepteur. Ces protéines présentent de nombreux sites potentiels de phosphorylation par la PKC et par la kinase GMPc dépendante. Le rôle éventuel de ces sites dans l'activation des arrestines n'a pas été élucidé. Contrairement aux arrestines visuelles, les b-arrestine-1 et -2 présentent une région C-terminale additionnelle de 15 acides aminés responsable de la liaison à la clathrine (Böhm et al., 1997a - Krupnick et Benovic, 1998) (figure 17).

- Rôle des arrestines dans la désensibilisation des RCPG :
Plusieurs stratégies expérimentales ont été utilisées pour démontrer le rôle des arrestines dans la désensibilisation des RCPG. A commencer par les essais réalisés avec des protéines purifiées utilisées in vitro dans des systèmes reconstitués. La b-arrestine-1 facilite la désensibilisation du récepteur b2-adrénergique précédemment phosphorylé par GRK2 (Lohse et al., 1990a). La liaison de la b-arrestine-1 au récepteur non phosphorylé est possible mais l'affinité et le potentiel d'inhibition sont fortement affectés (Sohlemann et al., 1995). La phosphorylation du récepteur par la PKA ne permet pas d'augmenter l'activité inhibitrice de la b-arrestine-1. Cette observation confirme que les arrestines contribuent de manière bien spécifique à la désensibilisation homologue mais pas à la désensibilisation hétérologue (Lohse et al., 1992).

Le rôle des arrestines dans la désensiblisation homologue des RCPG a également été illustré par des études effectuées sur cellules intactes ou perméabilisées. L'addition d'anticorps polyclonaux dirigés contre l'arrestine 3 bloque la désensibilisation des récepteurs de l'épithélium olfactif perméabilisé (Dawson et al.,1993). De même, sur cellules intactes, la co-expression des b-arrestines-1 et -2 avec les récepteurs b2-adrénergiques (Pippig et al., 1993), b1-adrénergiques (Freedman et al., 1995) et a1B-adrénergiques (Diviani et al., 1996) amplifie leur désensibilisation. L'utilisation de mutants dominants négatifs des arrestines a aussi permis de confirmer la fonction de ces protéines dans le découplage récepteur-protéine-G. L'implication des arrestines dans la signalisation des RCPG a pu être montrée pour des RCPG autres que la famille des récepteurs adrénergiques comme les récepteurs des glycoprotéines, follitropines (Nakamura et al., 1998), thyrotropines (Iacovelli et al., 1996) et choriogonadotropines (Lazari et al., 1998), le récepteur muscarinique M2 (Schlador et Nathanson, 1997) et les récepteurs opioïdes d et k (Cheng et al., 1998).