II-3 INTERNALISATION DES RCPG :
L'inactivation des RCPG, consécutive à la phosphorylation par les GRK et/ou les phosphorylases activées par les seconds messagers, se poursuit par leur disparition de la surface cellulaire. Les récepteurs endocytés vont traverser différents compartiments endosomaux et solliciter la participation de nombreuses protéines cellulaires. En privant le ligand de son récepteur, l'internalisation participe donc à la désensibilisation temporelle des RCPG. Néanmoins, si l'endocytose de ces complexes ligand-récepteurs constitue une étape de l'atténuation du signal de ces récepteurs, ce mécanisme est récemment apparu comme important pour la resensibilisation des RCPG et l'initiation d'une seconde cascade signalétique indépendante de la voie classique passant par les protéines-G.

II-31 Itinéraire des récepteurs endocytés :
Ce chapitre est consacré à la définition des caractéristiques principales (distribution, morphologie, propriétés cinétiques et chimiques, association de protéines spécifiques) de chaque compartiment endosomal traversé par le complexe ligand-récepteur internalisé ; L'ensemble de ces données permettant de mieux comprendre la fonction réservée à chaque type d'endosomes (tableau 6).

Figure 18

La grande majorité des récepteurs pénètre dans la cellule via les puits tapissés de clathrine ou "clathrin-coated pits" (CCP) et se retrouve au niveau de l'un des compartiments précoces de l'endocytose (EE, "early endosome") dans les cinq minutes qui suivent la scission des vésicules de la surface membranaire. Cet endosome primaire, formé par la coalescence des vésicules de clathrine (CCV, clathrin-coated vesicles) et localisé à la périphérie cellulaire est appelé "sorting endosome" (SE) : Lieu où s'effectue le tri des molécules qui seront recyclées à la membrane plasmique ou adressées vers les compartiments tardifs de l'endocytose (figure 18). La morphologie tubulo-vésiculaire (70% du volume dans les vésicules et 80% de la surface dans les tubules) et la valeur acide du pH (5,9 - 6,0) sont les propriétés essentielles de cet endosome (tableau 6). La dissociation du complexe ligand-récepteur résultant de cette acidification autorise le recyclage du récepteur et la dégradation du ligand. La neutralisation du pH par la monensine bloque cette dissociation et conduit à la séquestration du complexe dans ce compartiment (Kaiser et al., 1988).

Les molécules destinées à la surface cellulaire sont très rapidement adressées (T1/2 = 2 min) dans le compartiment de recyclage (RE, "recycling endosome"). La forme tubulaire associée à nombreuses varicosités, le pH moins acide (6,4 - 6,5) et la distribution éparse (dispersée à travers le cytoplasme ou périnucléaire) caractérisent ce type d'endosomes (tableau 6). Le recyclage des récepteurs à la membrane s'effectue selon deux cinétiques distinctes : une composante rapide (T1/2 = 5 min) et une composante lente (T1/2 = 15 - 30 min) (Gruenberg et Maxfield, 1995). La signification de cette variabilité cinétique pourrait être le reflet de la distance entre le compartiment de recyclage et la membrane plasmique. Sheff et al. ont montré que les récepteurs recyclés proviennent, en réalité, des deux populations endosomales (SE et RE) de l'endocytose précoce (Sheff et al., 1999) (figure 18). Un transport rétrograde du compartiment de recyclage vers les endosomes responsables du tri des molécules (SE) est également possible (Ghosh et Maxfield, 1995).

Le contenu des "sorting endosome" est ensuite délivré aux compartiments tardifs de l'endocytose. Trois populations endosomales peuvent être distinguées : les corps multivésiculaires (MVB, "multivesicular body" ou ECV, "endosomal carrier vesicles"), les endosomes tardifs (LE, "late endosome") et les lysosomes (Mukherjee et al., 1997). Les corps multivésiculaires se forment à partir du "sorting endosome" et fusionnent ensuite rapidement avec les endosomes tardifs (T1/2 = 6 - 8 min) (Gruenberg et Maxfield, 1995). Le rôle du cytosquelette est primordial à cette étape du transport de SE à LE (Griffiths et Gruenberg, 1991). La dépolymérisation des microtubules par le nocodazole, de même que l'inhibition de la protéine motrice dynéine, conduisent à une accumulation des corps multivésiculaires (Emans et al., 1993).

Les endosomes tardifs ont une structure caractéristique en forme "d'oignon" et une localisation essentiellement périnucléaire. Le bas pH relevé (5,0 - 6,0) dans ce compartiment est nécessaire à la dissociation du complexe hydrolases lysosomiales (E) - récepteurs au mannose-6-phosphate (M6PR) internalisé à partir de la surface cellulaire (figure 18). Le délai observé dans la dissociation M6PR-E protége de la dégradation les molécules situées dans le "sorting endosome" et destinées au recyclage.

Le contenu des endosomes tardifs est ensuite délivré aux lysosomes (pH 5,0 - 5,5) par fusion des endosomes tardifs avec les lysosomes pré-existants (Mullock et al., 1998). Cet organelle présente une morphologie hétérogène mais son identification est facilitée par la formation de corps denses en microscopie électronique (Holtzman, 1989). Les enzymes lysosomiales, déjà fonctionnels dans les endosomes tardifs, sont fortement concentrés dans les lysosomes et dégradent avec une activité optimale le contenu vésiculaire (figure 18). Il est à noter l'absence de M6PR des lysosomes.

Des échanges de matériels sont possibles entre les endosomes tardifs et le TGN (trans-Golgi network) ainsi qu'entre le compartiment de recyclage et le TGN. Après relarguage des enzymes lysosomiales, le récepteur au mannose-6-phosphate peut être recyclé vers le TGN (Kornfeld, 1992). Le TGN peut également adresser directement aux endosomes tardifs le complexe enzyme lysosomiale-M6PR (figure 18).

L'évolution de la compartimentation peut être suivie en microscopie confocale par immunodétection concommitante du récepteur et/ou du ligand avec des marqueurs endosomaux (tableau 6). Les petites GTPases rab4, rab5, rab11 sont spécifiques des compartiments précoces de l'endocytose (EE). La protéine Rab5 est présente dans les populations endosomales de tri et de recyclage (Gorvel et al., 1991 - Mohrmann et Van Der Sluijs, 1999) et rab11 est associée au compartiment de recyclage et au TGN (Ullrich et al., 1996 - Clague, 1998). La localisation de rab4 est plus controversée : Sa présence était jusqu'à maintenant indiquée dans le "sorting endosome" (Daro et al., 1996 - Sheff et al., 1999) mais une étude récente situe rab4 exclusivement au niveau des compartiments de recyclage (Mohrmann et van der Sluijs, 1999). Les protéines rab7 et rab9 caractérisent les compartiments tardifs de l'endocytose. D'autres protéines sont susceptibles de servir de marqueurs : Les endosomes tardifs et les lysosomes sont enrichis en glycoprotéines lysosomiales Lamp (lysosome-associated membrane proteins) et lgp (lysosomal membrane glycoproteins). Puisque les récepteurs au mannose-6-phosphate (M6PR) sont présents uniquement sur les endosomes tardifs, les lysosomes sont dits M6PR négatif et Lamp positif.