II-36 L'internalisation est-elle une étape de la désensibilisation, de la resensibilisation ou un mécanisme indépendant ?La régulation dynamique de la signalisation par les récepteurs couplés aux protéines-G nécessite le maintien de la balance entre les mécanismes contribuant à l'initiation, à l'arrêt et au rétablissement du signal. S'il ne fait plus aucun doute que l'endocytose des RCPG est liée à l'activation par l'agoniste (Koenig et Edwardson, 1997), les relations et les limites qui peuvent exister entre la désensibilisation, l'internalisation et la resensibilisation sont difficiles à établir. La situation est d'autant plus complexe que l'internalisation peut initier une seconde cascade signalétique indépendante de la voie classique passant par les protéines-G.
Les mutants dominants négatifs des différents partenaires impliqués dans l'internalisation des RCPG (dynamine, arrestine , GRK...), la mutagénèse dirigée des récepteurs, ainsi que le blocage de l'internalisation par certains agents (sucrose hyperosmolaire, concanavaline A, oxyde de phénylarsine (PAO), déplétion du potassium intracellulaire ou encore l'abaissement de la température) sont les moyens les plus couramment utilisés pour appréhender le rôle de l'endocytose des RCPG.

II-361 L'internalisation des RCPG : mécanisme possible pour la désensibilisation :
L'internalisation a tout d'abord été proposée comme un mécanisme de la désensibilisation des RCPG. A l'origine, cette idée est basée sur l'observation que la fraction membranaire contenant le récepteur b2-adrénergique séquestré est dépourvue d'activité Gs (Waldo et al., 1983). Des études similaires ont ensuite démontré que la désensibilisation rapide des récepteurs b2-adrénergiques s'accompagnait d'une translocation des récepteurs de la membrane plasmique vers la fraction vésiculaire (Mickey et al., 1975 - Strasser et al., 1984).

Plusieurs études sont ensuite venues confirmer ces premières observations. La mutation de la thréonine carboxy-terminale du récepteur muscarinique M3 provoque la perte de la séquestration et de la capacité à désensibiliser (Yang et al., 1995). L'internalisation semble également contribuer à la désensibilisation des récepteurs de la sécrétine (Holtmann et al., 1996) et de la somatostatine (Hipkin et al., 1997 - Beaumont et al., 1998). De plus, l'altération du nombre de récepteurs présents à la surface cellulaire apparaît être le déterminant majeur de la désensibilisation des récepteurs opioïdes m (Pak et al., 1996). En plaçant le récepteur dans un compartiment inaccessible à l'agoniste, l'internalisation participe donc à la désensibilisation temporelle des RCPG. Lohse et al. estiment, par exemple, que l'endocytose des récepteurs b2-adrénergiques contribue de 20 à 30 % à leur désensibilisation (Lohse et al., 1990b).

La majorité des études indique cependant que ces deux phénomènes sont distincts. En effet, l'inhibition de l'internalisation ne semble pas affecter la désensibilisation de récepteurs tels que le récepteur angiotensine II type 1A (Thomas et al., 1995), le récepteur dopamine D1 (Ng et al., 1995), le récepteur muscarinique M2 (Pals-Rylaarsdam et al., 1995 - Szekeres et al., 1998), le récepteur neurokinine NK-1 (Garland et al., 1996) ou encore le récepteur histaminique H2 (Fukushima et al., 1997b).


L'idée que l'internalisation puisse avoir un rôle plus important dans la resensibilisation (mécanisme par lequel les récepteurs sont endocytés, déphosphorylés et recyclés à la surface cellulaire) que dans la désensiblisation des récepteurs est liée à plusieurs observations expérimentales : (1) après stimulation par l'agoniste, les récepteurs isolés à partir des fractions endosomales présentent un degré de phosphorylation plus faible que les récepteurs associés à la membrane plasmique ; (2) les traitements pharmacologiques inhibant l'endocytose et le recyclage des récepteurs bloquent la resensibilisation sans affecter le couplage et la désensibilisation ; (3) des mutants déficients pour l'internalisation désensibilisent normalement mais ne resensibilisent pas.

L'endocytose participe au rétablissement du signal de nombreux neuropeptides et neurotransmetteurs. Les premières indications furent obtenues à partir d'études indirectes sur les récepteurs b2-adrénergiques (Staehelin et Simons, 1982 - Morrison et al., 1996). L'utilisation d'inhibiteurs de l'internalisation clathrine-dépendante (sucrose hyperosmolaire, concanavaline A) est ensuite venue confirmer le rôle direct de l'internalisation sur la resensibilisation des récepteurs b2-adrénergiques (Yu et al., 1993 - Pippig et al., 1995 - Krueger et al., 1997).

L'inhibition de l'endocytose bloque également la resensibilisation des récepteurs adénosines A2A (Mundell et Kelly, 1998), des récepteurs a1B-adrénergiques (Fonseca et al., 1995), des récepteurs bradykinines B2 (Prado et al., 1998), des récepteurs chimiokines CXC-R2 (Yang et al., 1999), des récepteurs muscariniques M2 (Szekeres et al., 1998), des récepteurs neurokinine NK-1 (Garland et al., 1996), des récepteurs opioïdes m (Koch et al., 1998 - Wolf et al., 1999), des récepteurs de la TRH (Yu et Hinkle., 1998), des récepteurs thrombines (Hein et al., 1994) et des récepteurs vasopressines V2 (Oakley et al., 1999).
Pour certains récepteurs, la relation directe entre l'endocytose et la resensibilisation n'est pas toujours simple. A l'inverse des récepteurs cités précédemment, l'internalisation n'est pas une étape indispensable à la resensibilisation des photorécepteurs rhodopsines (Krupnick et Benovic, 1998) ou des récepteurs prostaglandines (IP-R) (Mundell et Kelly, 1998). Certaines situations sont parfois encore plus surprenantes ; par exemple, l'inhibition de la séquestration des récepteurs muscariniques M4 accélère leur resensibilisation (Bogatkewitsch et al., 1996).

Si les mécanismes moléculaires liés à la désensibilisation des RCPG sont maintenant bien délimités, les différents partenaires impliqués dans l'internalisation et la resensibilisation demeurent moins bien définis. Néanmoins, plusieurs éléments de cette cascade signalétique ont pu être identifiés. Il s'avère que les protéines responsables de la désensibilisation (GRK et arrestines) contribuent directement à l'endocytose et au rétablissement de la réponse de plusieurs RCPG.
Tsuga et al. furent les premiers à démontrer que la phosphorylation du récepteur muscarinique M2, liée à la surexpression de GRK2 accélère l'internalisation. A l'inverse, la co-expression de ce même récepteur avec la protéine GRK2 mutante dominante négative réduit l'endocytose (Tsuga et al., 1994). Des études similaires réalisées sur les récepteur b2-adrénergiques ont ensuite confirmé ces premiers résultats (Ferguson et al., 1995 - Menard et al., 1996).

L'ensemble des données accumulées au cours de ces dernières années affirme également que les arrestines jouent un rôle direct dans l'endocytose et la resensibilisation des RCPG. Le récepteur b2-adrénergique constitue un système modèle : la surexpression des mutants dominants négatifs arrestines 2 (V53D) et arrestines 3 (V54D) bloque non seulement l'internalisation mais aussi la déphosphorylation et la resensibilisation de ces récepteurs (perte de fonction) (Ferguson et al., 1996). A l'inverse, la surexpression des arrestines sauvages 2 et 3 rétablit la capacité de resensibilisation du récepteur b2-adrénergique mutant Y326A (gain de fonction) (Zhang et al., 1997).

Le rôle des GRK et des arrestines dans l'internalisation et la resensibilisation des RCPG a pu être vérifié pour d'autres récepteurs : les récepteurs chimiokines CC-R5 (Aramori et al., 1997), les récepteurs dopaminergiques D2 (Itokawa et al., 1996), les récepteurs muscariniques M2 (Schlador et Nathanson, 1997) et les récepteurs vasopressines V2 (Oakley et al., 1999). Ce rôle pléiotrope des GRK et des arrestines dans la signalisation des RCPG avait déjà pu être montré pour les sous-unités bg des protéines-G (modulation de l'activité des effecteurs intracellulaires et cibles des GRK2 et 3 pour la liaison à la membrane).

La resensibilisation est un processus qui nécessite la dissociation du complexe ligand-récepteur dans les compartiments précoces de l'endocytose (sorting endosome), la déphosphorylation des récepteurs, la dissociation des arrestines et le recyclage des récepteurs à la surface cellulaire (figure 20 et 21) :

Figure 20

- La dissociation de l'agoniste du récepteur dépend de l'acidification progressive de l'appareil endosomal. La neutralisation du pH par la monensine bloque cette dissociation et conduit à la séquestration du complexe dans ce compartiment (Pippig et al., 1995). L'adressage vers les compartiments cellulaires peut varier selon le ligand étudié. Si pour la plupart des agonistes, l'adressage se fait vers les lysosomes (Böhm et al., 1997a), dans le cas de certains neuropeptides (neurotensine, par exemple) le ligand internalisé reste protégé de la dégradation enzymatique. Il est alors spécifiquement adressé vers un compartiment vésiculaire non acide, récemment identifié comme étant le complexe trans-Golgien par son immunoréactivité syntaxine-6 positive (Vandenbulcke et al., 1998). C'est également le cas de la somatostatine internalisée par l'intermédiaire du récepteur sst2A dans des cellules épithéliales transfectées (résultat non publié).



Figure 21

- La déphosphorylation du récepteur, critique pour la resensibilisation, est liée à une activité phosphatase (Shih et al., 1999). Récemment, une protéine phosphatase capable de s'associer et de déphosphoryler le récepteur b2-adrénergique a été identifiée (G-protein coupled receptor phosphatase, GRP) (Pitcher et al., 1995). Cette interaction GRP-récepteur semble également dépendre du pH intracellulaire des endosomes (Krueger et al., 1997). Une modification conformationnelle du récepteur, induite par l'acidification des vésicules est en effet requise pour que la déphosphorylation par la GRP puisse avoir lieu (Ferguson et Caron, 1998) (figure 20). L'inhibition de la déphosphorylation des phosphatases par la calyculine A ou l'acide okadaïque bloque la resensibilisation de ces récepteurs (Pippig et al., 1995 - Garland et al., 1996). L'importance de cette étape dans la resensibilisation des récepteurs est illustrée chez la drosophile : la déficience dans l'activité rhodopsine phosphatase est responsable de sérieux troubles dans la transduction visuelle (Vinos et al., 1997) .

- La dissociation des arrestines constitue également une étape de la resensibilisation (Zhang et al., 1997). L'hypothèse commune est que l'arrestine n'est pas libérée du récepteur désensibilisé au niveau de la membrane plasmique mais internalise dans les vésicules de clathrine (Ferguson et al., 1996 - Krupnick et Benovic, 1998). Si le mécanisme par lequel le complexe arrestine-récepteur est dissocié n'est pas encore caractérisé , de récentes observations démontrent cependant que le devenir de ce complexe varie d'un récepteur à l'autre (Zhang et al., 1999) (figure 20). Pour les récepteurs b2-adrénergiques, dopaminergiques D1A ou angiotensines II type 1A, la séparation s'effectue juste après la scission des vésicules de la membrane plasmique. Pour d'autres tels que les récepteurs endothéline ETA ou neurotensine NTS1 (Zhang et al., 1999), les arrestines accompagnent les récepteurs dans les compartiments précoces de l'endocytose. Cette différence observée dans la cinétique de dissociation du complexe arrestine-récepteur gouverne très certainement la vitesse de déphosphorylation et de recyclage du récepteur (Zhang et al., 1999 - Oakley et al., 1999). Dans le cas de la rhodopsine, il est même montré que l'interaction de l'arrestine visuelle avec le récepteur empêche la déphosphorylation et la resensibilisation (Palczewski et al., 1989).
Les arrestines sont donc des protéines impliquées non seulement dans les mécanismes d'arrêt du signal (désensibilisation) mais peuvent aussi initier et réguler les processus de resensibilisation des RCPG.

- Les récepteurs déphosphorylés sont ensuite dirigés vers les compartiment de recyclage avant d'être adressés à la surface cellulaire. Le retour à la membrane dans l'état de pré-exposition à l'agoniste s'effectue selon un mécanisme encore indéterminé (figure 20).

Les RCPG tels que les récepteurs de la thrombine (Hein et al., 1994) et les récepteurs activés par des sérines-protéases (PAR2) (Böhm et al., 1996) vont présenter un mécanisme de resensibilisation différent. Ces récepteurs, activés par clivage irréversible de leurs extrémités N-terminales sont internalisés dans les endosomes précoces et sont ensuite rapidement adressés aux lysosomes. Le recouvrement à la surface cellulaire va demander la mobilisation de stocks intracellulaires de récepteurs intacts et la synthèse protéique de nouveaux récepteurs. La resensibilisation de ces récepteurs peut être bloquée par la cycloheximide (inhibiteur de la synthèse protéique) et la brefeldine A (inhibiteur de la formation des vésicules en provenance du TGN) (figure 21).

A la suite d'une désensibilisation excessive ou chronique (dans certaines conditions pathologiques, par exemple) des récepteurs, les cellules peuvent être réfractaires à une nouvelle stimulation par l'agoniste. C'est dans ces situations physiopathologiques que l'on mesure l'importance de la resensibilisation des RCPG pour le maintien de l'homéostasie cellulaire normale (voir chapitre II-5 pathologies et thérapies liées aux mécanismes d'inactivation des RCPG).

II-363 L'internalisation des RCPG : délivrance d'une information à l'intérieur de la cellule :
On a déjà vu précédemment (chapitre I-14) que les RCPG, identifiés sur la base de leur interaction avec les protéines-G sont susceptibles de conduire un signal protéine-G indépendant par l'intermédiaire des protéines de type EVH et PDZ. Des travaux récents démontrent également que la séquestration des complexes ligand-récepteurs à l'intérieur des endosomes peut induire une nouvelle activité transductionnelle, distincte de celle opérant au niveau de la membrane.
Un tel mode de signalisation a déjà été proposé pour les récepteurs tyrosines kinases (Bevan et al., 1995 - Bergeron et al., 1995 - Grimes et al., 1996) : L'inhibition de l'endocytose du récepteur TrkA (nerve growth factor receptor) bloque la capacité du NGF (nerve growth factor) à phosphoryler le facteur de croissance CREB (transcription factor cAMP response element binding protein) (Riccio et al., 1997). De même, l'internalisation des récepteurs EGF (epidermal growth factor) et IGF-1 (insulin growth factor-1) régule l'activité des protéines de la voie MAP kinase (Vieira et al., 1996 - Chow et al., 1998).

Il est maintenant de plus en plus évident dans le cas des RCPG que l'internalisation du complexe ligand-récepteur est à l'origine de l'initiation d'une seconde cascade signalétique indépendante des protéines-G.

- Il est possible que l'internalisation prolonge la durée des mécanismes de transduction déjà opérants au niveau de la membrane en maintenant une activité transductrice au niveau endosomal. Cette observation a pu être faite pour les récepteurs de l'angiotensine II (Griendling et al., 1987) et de l'endothéline (Chun et al., 1995) dans les cellules musculaires lisses ainsi que pour les récepteurs de l'angiotensine II dans les cellules glomérulées de la surrénale (Hunyady et al., 1991).

- La séquestration des complexes ligand-récepteurs à l'intérieur des endosomes peut aussi déclencher une nouvelle cascade signalétique, distincte de celle initiée au niveau membranaire. Des travaux récents démontrent que l'internalisation des RCPG est responsable de l'activation de la voie MAP-kinase (Luttrell et al., 1999) et de la régulation de l'activité transcriptionnelle de certains gènes (Souazé et al., 1997). L'inhibition de l'endocytose clathrine-dépendante (par la concanavaline A, la déplétion du potassium intracellulaire, le sucrose hyperosmolaire, la monodansylcadavérine ou encore l'abaissement de la température) bloque l'activation des Erk kinases (extracellular-signal-regulated kinases) dans les fibroblastes de 1a rat (Luttrell et al., 1997). De la même façon, l'internalisation des récepteurs b2-adrénergiques (Daaka et al., 1998) et des récepteurs opioïdes d (Ignatova et al., 1999), entraîne une activation de la voie MAP-kinase. La capacité de ces RCPG à déclencher la voie MAP kinase nécessite l'activation du récepteur par l'agoniste et sa phosphorylation. Cependant, la dissociation du ligand et la déphosphorylation du récepteur effectives dans les compartiments précoces (SE), suggèrent que l'internalisation ne va pas pouvoir activer la cascade des MAP-kinases à partir de cet endosome. Cao et al. ont récemment distingué l'existence de deux sous-populations de vésicules à clathrine dans le stade précoce de l'endocytose (stade pré-SE) supportant l'idée d'une signalisation des récepteurs vers la voie MAP kinase avant la dissociation ligand-récepteur (Cao et al., 1998).

L'internalisation des récepteurs angiotensine II (AT1) (Lu et al., 1998), des récepteurs opioïdes k (Belcheva et al., 1996 - Ventura et al., 1998) et des récepteurs opioïdes d (Tencheva et al., 1997) peut aussi moduler l'activité transcriptionnelle de certains gènes. Par ailleurs, nos propres travaux ont démontré que l'internalisation ligand-dépendante des récepteurs de la somatostatine entraînait une inhibition protéine-G indépendante de l'expression de l'hormone de croissance dans les cellules hypophysaires AtT-20 (Sarret et al., 1999 - article III). De même, la distribution et l'expression des récepteurs de la somatostatine sst2A sont régulées via l'internalisation (Boudin et al., soumis pour publication - article IV).

L'internalisation via les cavéoles peut aussi déclencher une nouvelle cascade signalétique, distincte de celle initiée au niveau membranaire. L'inhibition de l'endocytose cavéole-dépendante par la filipine III bloque l'activation de la voie FA-kinase (focal adhesion kinase) par le complexe endothéline-1- récepteur ETB (Teixeira et al., 1999).