II-4 REGULATION NEGATIVE OU "DOWN REGULATION" DES RCPG :
La régulation négative ou "down regulation" se caractérise par une perte du nombre total de récepteurs de la surface cellulaire. Cette diminution est le résultat d'une exposition prolongée ou répétée de la cellule à la stimulation par un agoniste ou encore la conséquence d'un traitement à long terme par certaines drogues. Dans les conditions physiologiques, par opposition au processus de désensibilisation du récepteur par phosphorylation/découplage et internalisation, la régulation négative représente un mécanisme adaptatif rare. Ce n'est que dans certaines circonstances pathologiques (sécrétion continue d'une hormone par les cellules cancéreuses ou administration médicamenteuse fréquente d'un agoniste spécifique d'un récepteur donné) que la "down regulation" s'observe. Par exemple, l'exposition prolongée (> 1 heure) des cellules cardiaques de l'atrium à un agoniste spécifique cause la régulation négative des récepteurs muscariniques M2 (Bünemann et al., 1996). In vivo, ces mêmes récepteurs sont régulés de manière chronique après exposition répétée à l'acétylcholine (Bünemann et al., 1997). Le recouvrement de la "down regulation" est très lent (plusieurs jours sont parfois nécessaires) et requiert une nouvelle synthèse protéique du récepteur dégradé.

Figure 22

Les événements moléculaires impliqués dans la "down regulation" sont moins bien connus que ceux décrits pour la désensibilisation des RCPG. Néanmoins, les mécanismes susceptibles de diminuer le nombre de récepteurs d'un type donné passent par une augmentation de la dégradation des récepteurs pré-existants et/ou une réduction de leur synthèse (ARNm et protéine) (figure 22).


II-41 Dégradation des récepteurs :
L'exposition prolongée à un agoniste peut entrainer une réduction du nombre de récepteurs présents à la surface cellulaire, cette diminution résultant de la dégradation des récepteurs pré-existants dans un compartiment intracellulaire : les lysosomes. Un mécanisme plus rare, observé uniquement chez la levure, est également susceptible d'intervenir dans la dégradation des RCPG. Il s'agit de l'ubiquitination (figure 22).

II-411 Dégradation lysosomiale :
La plupart des informations sur la dégradation lysosomiale dérive d'études effectuées sur les récepteurs à un seul domaine transmembranaire tels que les récepteurs des facteurs de croissance. Néanmoins, le trafic des récepteurs des endosomes précoces vers les lysosomes constitue un mécanisme possible de la "down regulation" des RCPG. S'il ne fait plus aucun doute maintenant que cette dégradation est dépendante de l'activation des RCPG par l'agoniste (Kallal et al., 1998), il n'en est pas de même de l'interdépendance des processus d'internalisation et de "down regulation". Il est possible, tandis que la majorité des récepteurs séquestrés est recyclée à la surface cellulaire, qu'une petite fraction soit adressée aux lysosomes (von Zastrow et Kobilka, 1992). Cette idée est supportée par une récente étude indiquant que la surexpression d'une b-arrestine mutée inhibant l'endocytose réduit également le taux de dégradation du récepteur b2-adrénergique (Gagnon et al., 1998). La même observation a pu être faite pour les récepteurs neurokine NK-1 (Grady et al., 1995), lutropines/choriogonadotropine (Nakamura et al., 1999), muscarinique M3 (dans les cellules CHO) (Yang et al., 1995) et neurotensine NTS1 (Vandenbulcke et al., 1998).

Si les études précédemment citées semblent indiquer que l'internalisation constitue l'étape initiale de la dégradation lysosomiale des RCPG, d'autres données supposent l'existence de deux voies distinctes. Certains mutants du récepteur b2-adrénergique sont, en effet capables d'internaliser normalement mais perdent la capacité d'adressage aux lysosomes (Campbell et al., 1991). Et réciproquement, d'autres mutations du récepteur b2-adrénergique n'affectent pas la "down regulation" mais inhibe la séquestration (Barak et al., 1994). Cette observation est vraie pour les récepteurs muscariniques M1 (Lameh et al., 1992) et M2 (Tsuga et al., 1998) . De plus, les résidus tyrosines des récepteurs b2-adrénergique (Valiquette et al., 1990) et muscarinique M2 (Goldman et Nathanson, 1994) et les résidus thréonines du récepteur muscarinique M3 (dans les cellules HEK) (Yang et al., 1993) situés dans la queue C-terminale de ces récepteurs sont impliqués dans la dégradation lysosomiale de ces récepteurs mais pas dans leur internalisation. Certains résidus présents dans les régions i2 et i3 des RCPG sont également spécifiques de la voie de dégradation de ces récepteurs (Lee et Fraser, 1993 - Shockley et al., 1997). L'observation que la phosphorylation médiée par la PKA plutôt que par les GRK est associée à la "down regulation" des récepteurs renforce encore l'hypothèse que les RCPG peuvent être adressés aux lysosomes via une machinerie intracellulaire indépendante (Bouvier et al., 1989 - Jockers et al., 1999 - Zhang et al., 1996b).

II-412 Dégradation dépendante de l'ubiquitination :
L'ubiquitine est une protéine hautement conservée de 76 acides aminés présente dans toutes les cellules eucaryotes. L'ubiquitination des protéines cytoplasmiques mais aussi de certains récepteurs de surface constitue un signal de la dégradation rapide. Après de nombreuses étapes de modification du substrat, ce dernier aboutit aux compartiments de la "down regulation" que sont les lysosomes et le protéasome.

Le récepteur aux phéromones, Step2, présent chez Saccharomyces cerevisiae, est le seul récepteur à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines-G dont la "down regulation" est stimulée après ubiquitination (Hicke et Riezman, 1996). La séquence des événements est la suivante : après liaison de l'agoniste, le récepteur Step2 phosphorylé et modifié par ubiquitination est internalisé puis transporté à la vacuole (équivalent chez la levure du lysosome) où il est dégradé (Riezman, 1998). La lysine du motif SINNDAKSS situé dans la queue C-terminale de Step2 semble importante pour l'ubiquitination de ce récepteur (Rohrer et al., 1993a).

A ce jour, aucun exemple d'ubiquitination de RCPG de cellules de mammifères n'a été montré.


II-42 Diminution de la synthèse des récepteurs :
La seconde composante de la "down regulation" est la diminution de la synthèse des RCPG. Cette régulation négative est la conséquence de la diminution de l'expression génique et/ou de l'activation d'événements post-transcriptionnels tels que la déstabilisation des ARNm.

II-421 Réduction de la transcription génique :
L'analyse par la technique de "run off" a permis d'établir que la "down regulation" de certains récepteurs tels que les récepteurs muscariniques M2 et M4 (Habecker et al., 1993), le récepteur du PAF (platelet-activating factor) (Chau et al., 1994) ou encore le récepteur b2-adrénergique (Collins et al., 1991a) est en partie due à une réduction de leur expression génique. Les événements moléculaires susceptibles de médier cette inhibition sont peu décrits. Néanmoins, la régulation de la transcription génique semble être modulée par les seconds messagers tels que l'AMPc. Les effets médiés par l'AMPc sont liés à la fixation de facteurs de transcription (CREB, par exemple) sur des éléments de réponse à l'AMPc (CRE : cAMP response element) présents dans la région promotrice de certains gènes. La "down regulation" du récepteur b2-adrénergique par la protéine modulatrice CREM (CRE modulator) confirme cette hypothèse (Collins et al., 1991b) (figure 22).

II-422 Déstabilisation des ARNm :
La déstabilisation des ARNm est décrite comme la composante principale de la diminution de la synthèse des RCPG. Après une exposition prolongée à l'agoniste, ce mécanisme est, par exemple, susceptible de réduire de 50 à 90% le nombre de messagers des récepteurs b2-adrénergique (Hadcock et al., 1989), endothéline ETB (Sakai et al., 1992), muscarinique M1 (Lee et al., 1994), neurotensine (Souazé et al., 1997) ou encore thrombine (Tholanikunnel et al., 1995).
En dépit des nombreuses études recueillies à ce jour, il est difficile de savoir exactement ce qui est nécessaire ou indispensable à la "down regulation". Par exemple, la régulation négative du récepteur b2-adrénergique n'est pas altérée après la mutation des sites de phosphorylation de la PKA (Cheung et al., 1989). Il en est de même dans les cellules lymphoïdes s49 kin- (PKA inactive) (Shear et al., 1976). Par contre, l'utilisation de la forskoline ou d'analogues de l'AMPc semble induire la "down regulation" de ce même récepteur (Bouvier et al., 1989). Le rôle de la PKA est donc très controversé, mais il semble cependant que si l'AMPc/PKA n'est pas indispensable à la diminution de l'expression génique, il facilite malgré tout ce processus dans certains types cellulaires (Bouvier et al., 1989). L'implication de la PKA passe par la phosphorylation d'un facteur responsable de la dégradation sélective des ARNm d'un récepteur donné ou encore par l'induction de la transcription ou de la traduction de ce même facteur. Une protéine présentant ces caractéristiques a pu être identifiée pour le récepteur b2-adrénergique. La liaison de cette protéine de 35 kDa (b-adrénergic-receptor mRNA binding protein) aux ARNm de ce récepteur provoque leur déstabilisation (Port et al., 1992) (figure 22). Cette même protéine ne reconnait pas les messagers des récepteurs b1b- et b1-adrénergiques pour lesquels la "down regulation" est faible voir absente.

La position qui consiste à dire tel type de récepteur est attaché à tel type de mécanisme de régulation n'est pas applicable à la plupart des RCPG. En effet, la situation est parfois plus complexe puisque la "down regulation" d'un récepteur donné peut dépendre du type cellulaire (Koenig et Edwardson, 1996). Par exemple, la diminution du taux d'ARNm du récepteur b2-adrénergique via l'AMPc est médiée par la réduction de l'expression génique dans les cellules gliomales C6 et par la déstabilisation des messagers dans les cellules DDT1-MF2 (Danner et Lohse, 1997).