IV-12 La diversité des récepteurs de la neurotensine :

IV-121 Les deux familles de sites de liaison de la neurotensine :
La caractérisation des sites de liaison spécifique de la NT dans le système nerveux central a été rendue possible par la mise au point de ligands radiomarqués. Les premières études utilisant de la NT tritiée sur des membranes de cerveau ont indiqué que ce peptide se lie de façon spécifique, saturable et réversible à un site possédant une constante de dissociation (Kd) de l'ordre de 2-3 nM chez le rat et le cobaye (Uhl et al., 1977 ; Kitabgi et al., 1977).

Figure 25

Par la suite, l'utilisation de ligands iodés de plus haute activité spécifique, comme la ¹²⁵I-(Trp¹¹)-NT (Mazella et al., 1983) ou la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT (Sadoul et al., 1984) a permis de révéler deux types de sites de liaison sur des membranes de cerveaux de rat, de cobaye ou d'Homme : l'un de haute affinité pour la NT (NTRhigh, site H ; Kd = 0,1 - 0,3 nM - Bmax = 12-26 fmol/mg) et l'autre de basse affinité (NTRlow, site L ; Kd = 4 - 6 nM - Bmax = 73 - 147 fmol/mg) (figure 25).

La lévocabastine, un composé antihistaminique spécifique des récepteurs de sous-type H1, et non apparenté à la NT, possède la propriété d'inhiber la liaison des analogues radiomarqués de la NT au site de basse affinité (Schotte et al., 1986) (figure 25).

Trois sous-types de récepteurs à la NT ont été clonés à ce jour. Les deux premiers appartiennent à la famille des récepteurs à sept domaines couplés aux protéines-G (NTS1 et nts2) et le troisième (nts3) à un seul domaine TM constitue un nouveau type de récepteur aux neuropeptides (Vincent et al., 1999).


IV-122 Les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines-G (NTS1 et nts2) :

- Le récepteur NTS1 :

Figure 26

Un ADNc de 3,6 kb codant pour un récepteur de haute affinité pour la NT a été cloné dans le cerveau de rat (rNTS1), par la technique d'expression dans l'ovocyte de xénope (Tanaka et al., 1990). La protéine correspondante de 424 acides aminés (47 kDa) possède sept domaines transmembranaires caractéristiques de la famille des récepteurs couplés aux protéines-G (figure 26 et figure 28). La liaison de la NT (IC50 = 0,2 nM) à ce récepteur est insensible à la lévocabastine (Schotte et al., 1986 - Kitabgi et al., 1987). Le SR48692, un antagoniste non peptidique des récepteurs de la NT développé par SANOFI Recherche déplace la liaison de la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT avec une IC50 = 7,6 nM, sur membranes de cellules COS-7 transfectées par le rNTS1 (Gully et al., 1993).

Figure 27

Le clonage de l'équivalent humain (hNTS1) a été réalisé à partir de la lignée HT-29 originaire d'un adénocarcinome de côlon (Vita et al., 1993). Sa séquence protéique (418 aa) est à 84% identique à celle du récepteur de rat (figure 27). Plus récemment, ce récepteur, présent dans les neuroblastomes de souris N1E115 (Poustis et al.,1984), a également été cloné dans le cerveau de souris (424 aa, mNTS1) (Genbank, G3551525) (figure 28).

Figure 28

La liaison spécifique de la NT aux sites de haute affinité provoque des variations des taux intracellulaires d'IP3 (Hermans et al., 1992 - Watson et al., 1992 - Chabry et al., 1994), de GMP cyclique (Amar et al., 1985), d'AMP cyclique (Yamada et al., 1993b) et de calcium (Goedert et al., 1984). Enfin, dans les cellules CHO, la NT est capable d'activer la trancription du gène précoce Krox-24 suite à l'activation de la cascade des MAP Kinases par la protéine kinase C (Poinot-Chazel et al., 1996 - Portier et al.,1998).

- Le récepteur nts2 :
L'essentiel de mon activité scientifique sur le système neurotensinergique a porté sur la caractérisation du récepteur de basse affinité de la neurotensine de souris (mnts2) cloné au laboratoire par le Dr. Jean Mazella et le Dr. Jean-Marie Botto. La caractérisation des propriétés pharmacologiques et fonctionnelles de même que la localisation cérébrale de ce récepteur sont abordées plus loin (voir chapitre IV-2).

IV-123 Le récepteur à un seul domaine transmembranaire (nts3/GP95/sortiline) :
Les premières données concernant l'existence d'un récepteur de structure différente, distinct du NTS1 et du nts2, sont liées aux études de purification. Cette protéine, dont la masse moléculaire est d'environ 100 kDa, a été solubilisée à partir de cerveau de rat, de souris (Mazella et al., 1988 - Mazella et al., 1989) et d'homme (Zsürger et al., 1994) par le détergent CHAPS puis purifiée par chromatographie d'affinité. La connaissance des 23 premiers résidus a permis le clonage de ce récepteur à partir d'une banque de cerveau humain (Mazella et al., 1998). L'ADNc ainsi obtenu code pour une protéine de 833 amino-acides (hnts3) contenant un peptide signal de 33 résidus et un site potentiel de clivage par la furine (figure 27). La séquence primaire de cette protéine a révélé 100% d'identité avec la sortiline, une protéine purifiée et clonée sur la base de la reconnaissance avec la "receptor associated protein" (RAP) (Petersen et al., 1997 - Tauris et al., 1998), protéine endoplasmique présente dans le réticulum et l'appareil de Golgi et qui est impliquée dans l'adressage des récepteurs de la famille des récepteurs LDL (low density lipoprotein). Cette protéine nts3/GP95/sortiline possède une structure de type récepteur au mannose-6-phosphate avec une grande région extracellulaire N-terminale, un seul domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique très courte (Petersen et al., 1997) (figure 27).

Plus récemment, il a été montré que ce récepteur nts3/sortiline, localisé au niveau des vésicules intracellulaires contenant l'isoforme 4 du transporteur du glucose (Glut4) (Lin et al., 1997), peut être adressé à la surface membranaire en réponse à l'insuline dans les cellules adipeuses (Morris et al., 1998 - Kandror et Pilch, 1998). Cette localisation subcellulaire de la sortiline correspond à celle déjà décrite dans les neurones en culture primaire pour le récepteur de 100 kDa (Chabry et al., 1993).

La liaison de la NT iodée aux extraits solubilisés par le CHAPS de cellules COS-7 tranfectées avec l'ADNc codant pour le hnts3 est saturable et réversible avec une affinité de 10 à 15 nM. Les expériences de liaison et de marquage covalent montrent que le récepteur de 110 kDa peut être partiellement converti en un récepteur de meilleure affinité (Kd = 0,3 nM) de 100 kDa par cotransfection avec la furine. Ce récepteur de la NT de 100 kDa correspondant à la forme mature (Mazella et al., 1998). Ce récepteur est capable de reconnaître des ligands distincts de la NT, comme la LPL (lipoprotein lipase ; Nielsen et al., 1999), le propeptide du récepteur (ligand de 44 acides aminés correspondant au fragment clivé par la furine) (Petersen et al., 1999) et la RAP déjà citée (Petersen et al., 1997 - Tauris et al., 1998). Deux messagers de la sortiline de 3,5 kb et 8 kb sont exprimés dans les tissus humains, en particulier dans le système nerveux, la thyroïde, le coeur, le placenta, la moëlle épinière, le muscle squelettique et les testicules (Petersen et al., 1997). L'ontogenèse de ce récepteur effectuée par hybridation in situ montre une variation de l'intensité du signal au cours du développement en particulier au niveau du tube neural et de la rétine, et une accumulation des transcrits au niveau du cortex piriforme, du cortex cérébral et de la formation hippocampale chez l'adulte (Hermans Borgmeyer et al., 1999).

La connaissance de la séquence codant pour le récepteur nts3 chez l'homme (hnts3), nous a permis de réaliser le clonage par homologie, à partir d'une banque de cerveau de souris, d'un ADNc codant pour une protéine de 825 acides aminés (mnts3). Les propriétés de cet homologue murin sont actuellement en cours de caractérisation. Cependant des expériences préliminaires semblent indiquer que ce récepteur est capable non seulement d'internaliser après interaction avec le peptide mais également d'entraîner la NT vers le noyau. Ces résultats sont très intéressants compte tenu de l'importance des facteurs de croissance, présents dans le noyau, au cours de la prolifération cellulaire (résultat non publié).