IV-2 ETUDE DU RECEPTEUR DE BASSE AFFINITE DE LA NEUROTENSINE (nts2) :

IV-21 Clonage du récepteur de basse affinité de la neurotensine de souris (mnts2) :

Article V :
Mazella J., Botto J-M., Guillemare E., Coppola T., Sarret P. and Vincent J-P. (1996). Structure, functional expression, and cerebral localization of the levocabastine-sensitive neurotensin/neuromedin N receptor from mouse brain.J. Neurosci. 16, 5613-5620.


Par hybridation à stringence modérée d'une banque de cerveau de souris, en utilisant la phase codante du rNTS1, nous avons réalisé le clonage d'un ADNc de 1,6 kb (article V). La phase de lecture ouverte de cet ADNc code pour un récepteur de 416 acides aminés, de basse affinité pour la neurotensine (mnts2), présentant sept domaines hydrophobes caractéristiques des RCPG (figure 26). Sa séquence protéique est dépourvue de sites de N-glycosylation mais contient des sites potentiels de phosphorylation par la protéine kinase C et la caséine kinase II.

La séquence nucléique correspondant au récepteur de basse affinité pour la NT de rat (rnts2) a été clonée à partir d'hypothalamus en utilisant la même stratégie de clonage (Chalon et al., 1996). La protéine correspondante de 416 acides aminés possède respectivement 95 % et 43 % d'identité avec le mnts2 et le rNTS1 (figure 28). Plus récemment, l'ADNc codant le récepteur humain (hnts2 ; 410 aa) a également été cloné à partir du cortex (Vita et al., 1998) (figure 28). Le résidu d'aspartate (Asp), très conservé dans la famille des RCPG, est présent dans la séquence du NTS1 mais absent du TMII du nts2, remplacé par une alanine (Ala ; mnst2, rnts2) ou une glycine (Gly ; hnts2). Les expériences de mutagenèse dirigée ont permis de montrer que la substitution de cette Ala 79 du nts2 par un Asp restitue l'effet du sodium sur l'affinité de la NT mais pas la sensibilité aux analogues du GTP (Martin et al., 1999).

Figure 29

Le mnts2, exprimé transitoirement dans les cellules COS-7, lie la NT iodée avec une affinité de 2 nM. Les expériences de compétition de la liaison de la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT sur ce récepteur révèle une affinité similaire pour la neuromédine N, la Trp11-NT, la xénine et la lévocabastine (IC50 = 1 à 3 nM). La sensibilité à la lévocabastine indique que le mnts2 constitue la composante de basse affinité initialement décrite dans les membranes de cerveau de rat (Kitabgi et al., 1987) (figure 25). De plus, la localisation et le profil d'apparition de ces sites de basse affinité (abordé plus loin, chapitre IV-24) confirment les études antérieures d'ontogenèse faites sur ce récepteur (Schotte et Laduron, 1987 - Zsürger et al., 1992) (figure 29). L'affinité du nts2 humain pour cet antihistaminique H1 est plus faible (Kd = 91 nM) (Vita et al., 1998) que celle décrite pour le rat et la souris (résultat initialement observé par Schotte et Laduron, 1987).

L'injection de l'ARNc codant pour le mnts2 dans l'ovocyte de xénope induit un courant chlore entrant activé par le ca++ en réponse à la NT. Jusqu'alors considéré comme un site accepteur (ne transmettant pas de message intracellulaire après liaison de la NT), ce système d'expression permet la caractérisation d'un récepteur fonctionnel couplé à la phospholipase C. Il est intéressant de noter que la lévocabastine, qui est un antagoniste des récepteurs H1 de l'histamine, se comporte dans l'ovocyte de xénope comme un composé agoniste pour le mnts2.

La discrimination entre les deux types de récepteur (NTS1 et nts2) est possible en utilisant l'antagoniste SR48692, cet analogue reconnaissant préférentiellement les sites de haute affinité. La liaison de ¹²⁵I-(Tyr³)-NT est déplacée par le SR48692 avec une IC50 = 82 nM sur homogénat de cerveau de rat et une IC50 = 35 nM sur homogénat de cerveau de souris adulte. Ces valeurs tombent à 5 et 5,7 nM en présence de lévocabastine, qui inhibe spécifiquement la liaison de la iodo-NT aux sites de basse affinité (Gully et al., 1993). Sur membranes de cellules COS-7 transfectées par le nts2, ce dérivé non peptidique des récepteurs de la NT déplace la liaison de la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT avec une affinité apparente de 200 - 300 nM chez la souris (Mazella et al., 1996) contre 22 nM chez le rat (Chalon et al., 1996).

L'antagoniste de deuxième génération, le SR142948A, développé par SANOFI Recherche reconnaît avec une affinité similaire (IC50 = 1 - 4 nM) les récepteurs NTS1 et nts2 (rat ou souris) (Gully et al., 1997). Il est à noter que le hnts2 lie avec des affinités voisines les deux analogues, le SR48692 (IC50 = 67 nM) et le SR142948 (IC50 = 49 nM) (Vita et al., 1998).

L'analyse par northern-blot indique que les ARNm du mnts2 (1,8 Kb) sont principalement localisés dans le cerveau et le cervelet et sont totalement absents du coeur, du foie, des testicules et des reins. L'expression de ce récepteur augmente également avec l'âge pour atteindre un niveau maximum dans le cerveau de souris adulte. Ces résultats sont en accord avec les études ontogéniques antérieures (abordé plus loin, voir chapitre IV-242).