IV-23 Caractérisation du mnts2 en systèmes hétérologues. Expression dans les cellules eucaryotes en culture :

Article VII :
Botto J-M., Chabry J., Sarret P., Vincent J-P. and Mazella J. (1998). Stable expression of the mouse levocabastine-sensitive neurotensin receptor in HEK 293 cell line. Binding properties, photoaffinity labeling and internalization mechanism. Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 585-590.

Le nts2 de souris a été transfecté de manière stable dans les cellules embryonnaires de rein humain (HEK 293) afin d'étudier ses propriétés de liaison et d'internalisation (article VII). La NT se lie de façon spécifique, saturable et réversible à un site possédant une constante de dissociation (Kd) de l'ordre de 3 nM. En accord avec les résultats obtenus sur les cellules COS-7 transfectées transitoirement par le mnts2, les expériences de compétition de la liaison de la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT sur ce récepteur révèle une affinité similaire pour la neuromédine N, la Trp¹¹-NT, la xénine (IC50 = 2 à 4 nM) et l'antagoniste non peptidique SR48692 (IC50 = 80 nM). Dans ces cellules HEK 293, le nts2 conserve la sensibilité à la lévocabastine initialement décrite dans le cerveau de rat et de souris (Chalon et al., 1996 - article V). Bien que ce récepteur ne semble pas couplé aux systèmes cyclases (AMPc et GMPc) ou phospholipase C, dans cette lignée cellulaire, le mnts2 est capable d'internaliser la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT. L'endocytose du complexe ligand-récepteur (T_1/2 = 10 min) est suivie d'un recyclage du nts2 à la surface cellulaire (monensine sensible), phénomène qui n'est pas observé avec le NTS1. Néanmoins, la quantité de récepteurs nts2 séquestrés (60 %) est comparable à celle obtenue pour le NTS1 (Chabry et al., 1994). Cette différence de devenir intracellulaire du NTS1 et du nts2 après internalisation est probablement la conséquence des divergences de séquences dans l'extrémité C-terminale de ces protéines. Les motifs responsables de l'endocytose de ces deux récepteurs semblent aller dans cette voie. En effet, si pour le NTS1, les mutations ponctuelles de la Thr-422 et de la Thr-424 entraînent une perte quasi totale de l'internalisation de la NT (Chabry et al., 1995), la région responsable de l'endocytose du nts2 est située dans la troisième boucle intracellulaire (résultat non publié). La sensibilité du nts2 au sucrose hyperosmolaire (de même pour le NTS1) indique que cette internalisation se fait via les vésicules de clathrine. Cette supposition est renforcée par une étude récente montrant l'association du NTS1 à l'arrestine 3 lors de l'endocytose (Zhang et al., 1999).

La caractérisation biochimique du nst2 au niveau protéique a nécessité l'utilisation d'un dérivé radioactif photoactivable de la NT : l'azidobenzoyl-¹²⁵I-Tyr³-Trp¹¹-NT qui peut lorsqu'il est exposé aux U.V. se lier de manière covalente aux récepteurs (Mazella et al., 1985). Le marquage covalent réalisé sur les cellules HEK 293 intactes identifie une protéine de 45 kDa.

Si aucun couplage à des seconds messagers n'a pu être trouvé pour le mnts2 (exception faite du sytème d'expression dans l'ovocyte de xénope), la stimulation de la mobilisation intracellulaire de Ca⁺⁺ a pu être montré dans les cellules CHO transfectées par le rnts2 (Yamada et al., 1998). Dans ces mêmes cellules, le nts2 humain active la formation d'IP3 et la mobilisation du Ca⁺⁺, induit la libération de l'acide arachidonique via la phospholipase A2 et stimule l'activité MAP kinase (Vita et al., 1998).

Des différences pharmacologiques importantes sont à relever concernant l'action de la NT, de la lévocabastine et du SR48692 sur ces trois récepteurs clonés :

- Le récepteur nts2 de souris, exprimé dans l'ovocyte de xénope active un courant chlore entrant en réponse à la NT et à la lévocabastine (initialement décrit comme un antagoniste des récepteurs H1 de l'histamine) (article V). De manière étonnante, le SR48692 est incapable de s'opposer aux effets de la NT et se comporte même, dans ce système d'expression, comme un agoniste pour le mnts2 et ce avec une affinité équivalente à la NT (Botto et al., 1997b). A noter que le SR48692 n'inhibe pas non plus l'action de la NT via le rNTS1 (Botto et al., 1997b).

- La mobilisation du Ca⁺⁺ intracellulaire, dans les cellules CHO transfectées par le rnts2, est activée en présence de NT. Cependant, cette stimulation est faible comparée à celle obtenue avec la lévocabastine et le SR48692 (Yamada et al., 1998).

- Si les données recueillies sur les récepteurs nts2 de souris et de rat mènent sensiblement à la même conclusion, l'interprétation du mode d'action de ces différents composés est considérablement compliquée par les résultats obtenus sur le nts2 humain. En effet, le SR48692 de même que le SR142948A se comportent comme de puissants agonistes sur le hnts2 exprimé dans les cellules CHO, alors que la NT la neuromédine N et la lévocabastine montrent une activité de type antagoniste (Vita et al., 1998).