IV-24 Distribution régionale et cellulaire des ARNm du mnts2 dans le cerveau de souris adulte et au cours du développement :

Article VIII :
Sarret P., Beaudet A., Vincent J-P. and Mazella J. (1998b). Regional and cellular distribution of the low affinity neurotensin receptor mRNA in adult and developing mouse brain. J. Comp. Neurol. 394, 344-356.

Le clonage de l'ADNc codant pour le récepteur de basse affinité pour la NT (article V), a permis de disposer d'une sonde spécifique de ce sous-type de récepteur afin de le localiser spécifiquement par hybridation in situ (ou encore par northern blot). Alors que l'étude autoradiographique des sites de liaison de la NT permet de positionner les régions exprimant le récepteur, l'hybridation in situ indique celles où l'ARN est transcrit.

La présence de transcrits correspondant au nts2 au niveau du cortex cérébral et de l'hypothalamus avait déjà pu être visualisée par l'analyse en northern blot chez la souris (article V - article VI), le rat (Chalon et al., 1996) et l'homme (Vita et al., 1998).


IV-241 Distribution des ARNm du nts2 dans le cerveau de souris adulte :
L'analyse des films autoradiographiques d'une série de coupes coronales et sagittales de cerveau de souris adulte, obtenues en utilisant une ou deux ribosondes différentes marquées au 33P, révèle une large distribution des ARNm codant le nts2 (article VIII). Cette localisation dispersée des messagers du nts2 est corrélée aux premières études autoradiographiques des sites de liaison de basse affinité sur coupes de cerveau de rat, obtenue par soustraction après incubation de la NT iodée (Kitabgi et al., 1987) ou tritiée (Schotte et al., 1986), en présence ou en l'absence de lévocabastine. De plus, les plus fortes concentrations de messagers sont détectées dans les régions précédemment décrites comme présentant de grandes quantités de sites de liaison à la NT sensibles à la lévocabastine (Kitabgi et al., 1987).

Les ARNm du mnts2, révélés par hybridation in situ, sont principalement localisés dans le système olfactif (bulbe olfactif, noyau olfactif antérieur), les cortex cérébraux (cortex piriforme, rétrosplénial et entorhinal) et cérébelleux (ainsi qu'un certain nombre de noyaux associés : noyau rouge, noyaux pontiques et noyaux vestibulaires), les tubercules olfactifs, la formation hippocampique, le complexe de l'amygdale et certains noyaux thalamiques (noyau habénulaire médian) et hypothalamiques (noyaux supraoptique, dorsomédian, ventromédian et arqué). Des signaux intenses d'hybridation sont également associés aux sytèmes auditif (noyaux de l'olive supérieure et cochléaire ventral, tubercule quadrijumeau inférieur et corps genouillé médian), visuel (noyau suprachiasmatique, corps genouillé latéral) et somatosensoriel (noyau principal du nerf trijumeau) suggérant que le nts2 pourrait être impliqué dans la modulation des voies afférentes sensorielles.

Finalement, les ARNm du nts2 sont prédominants dans les structures impliquées dans les influences descendantes antinociceptives telles que l'aire grise périaqueductale (PAG), le noyau du raphé magnus, les noyaux réticulés gigantocellulaires et les noyaux paragigantocellulaires (pars alpha et latéral). La localisation de ce récepteur au niveau de structures supraspinales impliquées dans la transduction de l'effet analgésique de la NT vient confirmer les résultats de nombreuses études antérieures (Kalivas et al., 1982a - Kalivas et al., 1982b - Behbehani et Pert, 1984 - al-Rhodan, 1991). Il est à noter l'absence d'expression du nts2 à l'intérieur des voies ascendantes nociceptives, notamment au niveau de la moëlle épinière (substantia gelatinosa) et du noyau trijumeau spinal, en accord avec les résultats obtenus en RT-PCR (article VI).

Les ARNm du mnts2 sont très peu exprimés dans les régions responsables du contrôle de l'hypothermie (aire préoptique et hypothalamique antérieure). Si l'on corrèle cette faible expression des ARNm du nts2 aux résultats rapportés par d'autres équipes montrant que la lévocabastine ne fait pas compétition aux effets hypothermiants de la NT (Tyler et al., 1998a - Dubuc et al., 1999b), on est en droit de se demander si un récepteur non encore identifié est responsable de l'action de la NT sur l'hypothermie.

Au niveau cellulaire, les grains d'argent semblent se concentrer au niveau des neurones. Néanmoins, quelques cellules présentant les caractéristiques cytologiques des cellules gliales sont également marquées occasionnellement. La présence de sites de liaison à la NT sensibles à la lévocabastine est d'ailleurs déjà décrite pour une sous population de cellules gliales, les astrocytes (Nouel et al., 1997b - abordé plus loin, voir chapitre IV-25). La similarité entre la distribution des messagers du nts2 et les sites de liaison à la NT (Kitabgi et al., 1987 - Schotte et al., 1986) suggère que les récepteurs sont essentiellement somatodendritiques. Toutefois, il n'est pas exclu que les terminaisons afférentes à ces neurones véhiculent le récepteur vers d'autres aires cérébrales.

La distribution des ARNm du nts2 diffère, de manière significative, de celle des ARNm du NTS1 visualisée dans le cerveau de rat (Elde et al., 1990 - Sato et al., 1992 - Nicot et al., 1994 - Alexander et Leeman, 1998) et/ou de la localisation du récepteur NTS1 observée par immunohistochimie en utilisant un anticorps spécifique (Boudin et al., 1996). La distribution cérébrale diffuse des transcrits du nts2 contraste avec la localisation spécifique des ARNm du NTS1 et par conséquent, aucune structure contenant les messagers du récepteur de haute affinité n'est totalement dépourvue des ARNm du nts2. Seulement deux profils d'expression sont alors envisageables :

- La plupart des régions exprimant le nts2 sont dépourvues ou n'expriment que de faibles quantités d'ARNm du NTS1. On retrouve, par exemple, la PAG, le dentate gyrus, l'habenula médiale, les noyaux de l'amygdale corticale, la zona incerta, les tubercules quadrijumeaux supérieurs ou encore la strie terminale (bed nucleus)

- Il existe cependant quelques régions où l'expression de ces deux récepteurs se superpose comme le septum médian, la bandelette diagonale de Broca, le noyau réticulaire du thalamus et le noyau suprachiasmatique de l'hypothalamus, les noyaux pontiques et olfactifs antérieurs et les cortex rétrosplénial et entorhinal. La présence de ces récepteurs dans la même aire cérébrale suggère la possibilité de voir le NTS1 et le nts2 coexprimés dans la même cellule neuronale.

IV-242 Profil ontogénique de l'expression du nts2 dans le cerveau de souris :
Le profil ontogénique de l'expression du nts2 dans le cerveau de souris a été suivi du 7ème jour postnatal à l'âge adulte. L'ARNm du nts2 n'apparaît qu'à partir du 14ème jour postnatal et croît progressivement jusqu'au 30ème jour. L'expression maximale correspondant au stade adulte est atteinte entre le 30ème et le 60ème jour. Les régions où les ARNm sont détectés au stade 14 jours sont celles où l'intensité du signal est maximale à l'âge adulte (la couche des cellules pyramidales de l'hippocampe, l'habénula médiale, le cortex piriforme, par exemple). Ce profil tardif de développement est conforme à nos résultats obtenus par northern blot (article V). De même, l'autoradiographie des sites de liaison à la NT sensible à la lévocabastine montre que les récepteurs de basse affinité apparaissent à partir du 15ème jour postnatal chez le rat et la souris et atteignent le niveau maximal après 30 jours (Schotte et Laduron, 1987 - Zsürger et al., 1992) (figure 29). Chez l'homme, le nts2 apparaît 150 jours après la naissance (Zsürger et al., 1992).

L'ontogenèse de l'expression du NTS1 dans le cerveau de rat, effectuée par northern blot (Hermans et al., 1993 - article V) ou par hybridation in situ (Sato et al., 1992 - Lépée-Lorgeoux et al., 1999) présente des différences marquées à celle du nts2. Les ARNm du NTS1 sont présents dans le cerveau dès la naissance avec une expression maximale entre le 7ème et le 10ème jour postnatal chez le rat et la souris, puis décroissent progressivement pour disparaître après le 30ème jour (figure 29). De plus, à l'inverse de nos résultats sur le nts2, le profil d'expression du NTS1, défini par autoradiographie des sites de liaison (Palacios et al., 1988) et par hybridation in situ (Sato et al., 1992) peut varier d'une région à une autre au cours du développement.

Il est intéressant de noter que dans le cortex cérébral l'augmentation de l'expression du nts2 au cours du développement est corrélée à la diminution de l'expression du NTS1 suggérant que, dans cette structure, la médiation du signal neurotensinergique pourrait être assurée successivement par chacun des deux types de récepteurs.

La distribution régionale de même que le profil ontogénique des ARNm du nts2 décrits ici pour la souris diffèrent en certains points des données rapportées pour le nts2 de rat (Walker et al., 1998 - Lépée-Lorgeoux et al., 1999). Par exemple, le nts2 est fortement exprimé dans le cortex piriforme, le tubercule olfactif et le système olfactif (noyau olfactif antérieur) chez la souris (article VIII) alors que le marquage n'est pas très intense chez le rat (Walker et al., 1998 - Lépée-Lorgeoux et al., 1999). A l'inverse, l'habenula latérale, certains noyaux hypothalamiques (noyaux paraventriculaires, par exemple) et la substance blanche sont des régions marquées exclusivement chez le rat. De même, aucun signal d'hybridation n'est observé dans la moëlle épinière chez la souris.

Au niveau cellulaire, alors que les ARNm du nts2 de rat se retrouvent dans les cellules épendymales, gliales et neuronales, les transcrits correspondants au nts2 chez la souris sont essentiellement concentrés dans les neurones (bien qu'un marquage au niveau glial n'est pas exclu). De plus, le signal d'hybridation intense observé dans le cortex cérébelleux ne concerne pas la même couche cellulaire ; Cellules de purkinje chez le rat et cellules granulaires chez la souris.

Des différences sont également à relever sur le plan de l'ontogenèse. En effet, si le niveau d'expression du nts2 semblent croître de facon homogène d'une région à l'autre au cours du développement chez la souris, trois profils ontogéniques sont distingués chez le rat (Lépée-Lorgeoux et al., 1999). En utilisant des sondes oligonucléotidiques marquées au 35S, Lépée-Lorgeoux et al. montrent, par exemple, que le marquage des cellules pyramidales de l'hippocampe n'apparaît qu'au stade tardif (30ème jour postnatal) alors qu'il est déjà décelable au 10ème jour chez la souris (article VIII).