IV-25 Caractérisation pharmacologique, moléculaire et fonctionnelle des récepteurs NT au niveau glial :

Article IX :
Nouel D., Sarret P., Vincent J-P., Mazella J. and Beaudet A. (1999). Pharmacological, molecular and functionnal characterization of glial neurotensin receptors. Neuroscience. 94, 1189-1197.

La localisation des ARNm du nts2, par hybridation in situ, dans le cerveau normal de souris n'a pas permis de déterminer avec certitude la présence ou non de ce récepteur au niveau glial. Néanmoins, les études d'ontogenèse des récepteurs centraux de la NT ont montré que le nts2 apparaissait tardivement après la naissance (entre le 10ème et 15 jour) chez les espèces murines atteignant progressivement le niveau d'expression de l'adulte (Schotte et Laduron, 1987 - Zsürger et al., 1992 - Lépée-Lorgeoux et al., 1999 - article VIII). Ce profil d'apparition des récepteurs de basse affinité coïncide avec le développement des cellules gliales dans le système nerveux central, ce qui suggère la présence éventuelle de ces sites sur ce type cellulaire (Kitabgi et al., 1987 - Schotte et Laduron, 1987). D'ailleurs, une étude réalisée par microscopie confocale en employant un analogue fluorescent de la NT a montré l'existence de sites de liaison pour la NT, sensibles à la lévocabastine, à la surface de cellules gliales en culture primaire (en particulier les astrocytes) (Nouel et al., 1997b). De plus, l'injection dans le striatum d'acide kaïnique entraine une diminution transitoire du nombre de sites de basse affinité. L'apparition massive du nts2 qui s'ensuit, suggère que ces sites de liaison sensibles à la lévocabastine sont exprimés par les cellules gliales car elles seules se multiplient après lésion (Schotte et al., 1988). Toutefois, les études réalisées par hybridation in situ semblent indiquer que l'expression du nts2 est concentrée au niveau neuronal (article VIII - Walker et al., 1998).

Afin de déterminer si l'association des récepteurs nts2 aux cellules gliales est liée à la réactivité gliale ou à l'existence de sites de liaison de basse affinité distincts du nts2, nous avons entrepris, en collaboration avec le Dr. Dominique Nouel et le Pr. Alain Beaudet (à l'Institut Neurologique de Montréal), la caractérisation des propriétés pharmacologiques et moléculaires des récepteurs NT exprimés par les astrocytes en culture primaire. Dans le même temps, nous avons suivi l'évolution de l'expression de ces récepteurs sur des coupes de cerveau de rat avant et après lésion.

Les expériences de liaison de la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT effectuées sur les cellules gliales corticales en culture primaire révèlent la présence d'une seule population apparente de sites de liaison à la NT. De plus, l'affinité pour la NT (Kd = 6 nM) est comparable aux données décrites pour le récepteur de basse affinité exprimé dans les cellules eucaryotes transfectées (Chalon et al., 1996 - Botto et al., 1998 - Vita et al., 1998 - Yamada et al., 1998). La liaison de la ¹²⁵I-(Tyr³)-NT est aussi déplacée par la lévocabastine et dans une moindre mesure par l'antagoniste SR48692. Les différences significatives d'affinité de la lévocabastine et du SR48692 relevées sur les cellules gliales et les sytèmes d'expression hétérologues suggèrent la présence d'un site supplémentaire ou distinct à la surface de ces cellules gliales. Les expériences de RT-PCR réalisées sur les ARNm extraits des cellules gliales corticales vont dans ce sens et montrent la présence du nts2 mais également celle du nts3 sur ce type cellulaire. L'absence d'expression du NTS1 au niveau glial est conforme aux études précédentes d'immunohistochimie (Boudin et al., 1996) et d'hybridation in situ (Elde et al., 1990 - Nicot et al., 1994 - Alexander et Leeman, 1998).

La visualisation par imagerie en microscopie confocale d'un analogue fluorescent de la NT démontre d'une part que les sites de liaison concernent seulement une population des astrocytes en culture mais confirme aussi d'autre part l'absence d'internalisation du complexe ligand-récepteur sur ce type cellulaire (Nouel et al., 1997b).

Figure 30

Afin de confirmer avec certitude la présence du nts2 au niveau glial, nous avons effectué des expériences de double marquage en combinant l'hybridation in situ des ARNm du récepteur de basse affinité et le marquage enzymatique des cellules gliales (GFAP, glial fibrillary acidic protein). Dans le même temps, nous avons suivi l'expression de ce récepteur sur des coupes de cerveau de rat normal et lésé (lésion mécanique) (figure 30). Sur les coupes de rat normal, la colocalisation des astrocytes GFAP positifs et des récepteurs de basse affinité est très faible. Par contre, après lésion, le nombre d'astrocytes exprimant le nts2 ainsi que la quantité d'ARNm nts2 exprimée par cellule gliale individuelle sont fortement accrus (figure 30), résultat en accord avec les effets provoqués par l'acide kaïnique (schotte et al., 1988). L'augmentation de l'expression du nts2 au cours de la régénération gliale suggère que ce récepteur pourrait, en réponse à une agression quelconque, être impliqué dans la régulation de la réponse inflammatoire.