V. Régulation cellulaire des récepteurs D1 :

V.A. La désensibilisation des récepteurs D1 :

V.A.1. Les observations préliminaires

V.A.2. La première étape : le découpage fonctionnel :

La phosphorylation du récepteur intervient dès la fixation du ligand (Figure 18). Deux classes principales de protéines kinases sont impliquées dans ce phénomène : la PKA et les GRK. La PKA est, semble-t-il, généralement utilisée dans les mécanismes de phosphorylation sans spécificité pour une classe de récepteurs. Par contre les GRK sont plus spécifiques de l'interaction ligand/récepteur.


a. Les protéines kinases non spécifiques :

L'implication de kinases dans les phénomènes de désensibilisation hétérologue a été observée pour les récepteurs D1 dans la rétine de bœuf (Ackerman et Gnegy, 1990). Ainsi, la dépolarisation due au potassium est capable de désensibiliser les récepteurs D1 en découplant les récepteurs des voies de signalisation. Cet effet est mimé par des produits augmentant le taux d'AMPc dans les neurones de la rétine. L'analyse du rôle de la PKA dans la désensibilisation du récepteur D1A a été effectuée précisément par expression du récepteur dans des lignées mutantes CHO exprimant différents taux de PKA (Sibley et al., 1998). Dans les lignées cellulaires contenant le moins d'activité PKA, la désensibilisation se produit très lentement ce qui semble indiquer un rôle majeur de cette enzyme dans la régulation du récepteur. De plus, la PKA intervient aussi bien dans le découplage rapide que dans la régulation à long terme, impliquant la diminution du nombre de récepteurs. A l'aide de mutants des sites possibles de phosphorylation par la PKA (Thr 135, Ser 229, Thr 268, Ser 380), ces mêmes auteurs montrent que la phosphorylation du récepteur par la PKA permet d'augmenter la vitesse de la désensibilisation. En effet, le temps nécessaire pour atteindre la désensibilisation maximale est de 3 heures pour le mutant contre 1 heure pour le récepteur sauvage. La mutagenèse dirigée de la thréonine 268 du récepteur D1A de rat confirme qu'elle est nécessaire à la cinétique naturelle de la désensibilisation (Jiang et Sibley, 1999). Lorsque cet acide aminé est muté en valine la baisse d'accumulation d'AMPc est plus lente. Ainsi au bout d'1 heure quand le récepteur sauvage est désensibilisé de 80 % de la réponse maximale le mutant ne l'est que de 20%. Toutefois la désensibilisation maximale est toujours obtenue ce qui veut dire que d'autres types de mécanismes entrent en jeu. La mutation simultanée des quatre sites potentiels de phosphorylation par la PKA n'apporte rien de plus que le mutant Thr 268 seul, sans modification ni des capacités de liaison des agonistes ni de l'activation de l'adénylate cyclase (Figure 15). In vitro, la PKA est capable de phosphoryler la région C-terminale du récepteur D1A humain alors que la PKC n'a aucune action (Zamanillo et al., 1995). Par contre, aucune de ces deux kinases n'est capable de phosphoryler in vitro la région C-terminale du récepteur D1B. La mutagenèse de la sérine 380 en alanine dans le récepteur D1A abolit cette phosphorylation. La diversité des observations effectuées après mutagenèse rend très incertain l'emploi de tels outils pour l'analyse des mécanismes physiologiques précis.

L'analyse de l'expression stable du récepteur D1 dans des cellules de rein d'opossum a été faite en parallèle avec l'expression stable de l'ADNc d'une phosphodiestérase (rPDE3) afin d'étudier l'incidence de l'accumulation d'AMPc sur la désensibilisation de ce récepteur (Bates et al., 1993). Après un prétraitement d'une heure avec 1µM de dopamine, la capacité d'accumulation d'AMPc n'est modifiée dans aucune des lignées cellulaires exprimant les deux transcrits exogènes (récepteur et phosphodiestérase) et reste proche de celle des cellules n'exprimant que le récepteur D1 soit environ 40 à 50% de diminution. Par contre, la diminution du nombre de récepteurs, mesuré par liaison, est modifiée et elle même supprimée dans certains clones. En revanche, sans la surexpression de la phosphodiestérase, cette diminution est de 45 %. Ces expériences indiquent que si l'accumulation d'AMPc ne semble pas influencer le découplage fonctionnel, par contre, elle intervient dans l'internalisation du récepteur. Cette modification pourrait provenir d'un changement dans l'activité de la PKA, très diminuée dans les lignées exprimant la phosphodiestérase. En conclusion, si le rôle de la PKA est important dans la cinétique de la désensibilisation, ce n'est pas la seule kinase mise en jeu.


b. Les kinases associées aux récepteurs couplés aux protéines G (GRK) :

Le rôle des GRK a été montré par un certain nombre de moyens comme la surexpression, ou l'utilisation d'anticorps inhibant leur fonction (Figure 19). La surexpression de GRK2 augmente la désensibilisation du récepteur b2-adrénergique (Pippig et al., 1993), alors que la surexpression d'un dominant négatif l'atténue (Kong et al., 1994). Les GRK sont spécifiques des récepteurs ayant fixé un agoniste, mais elles ne possèdent pas de profils distincts de reconnaissance des récepteurs (pour revue sur les GRK voir Inglese et al., 1993; Pitcher et al., 1998a et Tableau 12). Les sensibilités des récepteurs aux différentes GRK varient selon les familles de récepteurs (pour revue voir Carman et Benovic, 1998). Ainsi, les sous-types de récepteurs adénosine (A1, A2A, A2B et A3) et a-adrénergiques (a1B, a2A, a2B, a2) sont sensibles à GRK2 ou GRK3 sans différences visibles. Plus précisément les GRK2, 5 et 6 sont capables de phosphoryler le récepteur a2A mais pas le récepteur a2C (Jewell-Motz et Liggett, 1996). Des expériences similaires sur le récepteur a2B montrent que les GRK2, 3 et 6 peuvent phosphoryler le récepteur en présence du ligand alors que la GRK5 ne le permet pas (Diviani et al., 1996). Dans tous les cas, les sous-types GRK2 et 3 semblent les plus utilisées, ce qui exclut une quelconque spécificité de ces protéines dans la régulation différentielle, récepteur spécifique, de la désensibilisation. De plus, dans des expériences de sauvetage d'un mutant du récepteur b2-adrénergique incapable d'être séquestré, la surpexpression de toutes les GRK sauf GRK1 permet de récupérer un phénotype normal (Ménard et al., 1996). Il ne semble pas y avoir non plus de spécificité entre GRK2 et les différents sous-types de récepteur muscarinique humain M1 à M5. Par contre les GRK4 et 5 ne modulent que M2 et GRK6 est visiblement sans effet sur la séquestration de ces récepteurs (Tsuga et al., 1998). L'utilisation d'anticorps capables d'inhiber spécifiquement l'action des GRK2/3 ou GRK4/5/6 permet d'approcher d'une autre manière la spécificité GRK/récepteurs (Opperman et al., 1996). Dans des myocytes de lapin, l'utilisation d'anticorps contre les protéines GRK2/3 inhibe 77 % de la phosphorylation des récepteurs




Figure 19 : Caractéristiques des protéines kinases des récepteurs couplés aux protéines G (GRK). Pour chacune des six GRK sont donnés le nom commun, la taille en kDa, la localisation et les particularités de chacune. Au-dessus du tableau, la structure de chacune des GRK est schématisée. RK, Rhodopsin Kinase; PH, Pleckstrin Homology. Localisation : r, rein; p, poumon; c, cœur; l, leucocytes; sn, cerveau; ra, rate; pl, placenta; pa, pancreas; m, muscles squeletiques et f, foie.



b2-adrénergiques induite par l'isoprotérénol, alors que les anticorps anti-GRK4/5/6 sont sans effets. Ces interactions différentielles avec les récepteurs ont aussi été observées pour les récepteurs D2 (Ito et al., 1999). Lorsque l'on exprime les récepteurs D2 dans les cellules COS-7, on n'observe pas de séquestration, alors que la coexpression avec GRK2 entraîne une séquestration de 50% du récepteur D2S et de 36 % du récepteur D2L après 2 heures de traitement à la dopamine (100 mM). En présence de GRK5, la séquestration est aussi facilitée, mais de seulement 36% pour le récepteur D2S. Ce phénomène est sensible à l'hypertonicité du milieu ce qui est caractéristique des mécanismes d'internalisation impliquant la clathrine. Au vu de tous ces résultats, il semble donc que les GRK jouent un rôle précis à une étape particulière de la désensibilisation plutôt qu'elles possèdent une spécificité d'association à un récepteur particulier.


Tableau 12 : Les récepteurs substrats des kinases des récepteurs couplés aux protéines G, GRK (d'après Carman et Benovic, 1998; Pitcher et al., 1998a). Analyse de la spécificité des GRK pour différents récepteurs couplés aux protéines G. Les techniques d'analyse sont : Anticorps, l'utilisation d'anticorps inhibiteurs spécifiques des GRK; AS, construction d'oligonucléotides antisens des GRK; DN, surexpression d'un mutant spécifique dominant négatif, In vitro, dosage dans des cellules reconstituées avec des GRK purifiées; SE, surexpression de GRK spécifiques et Transgénique, surexpression transgénique ou inactivation des GRK. Les méthodes d'analyses employées sont : Phosphorylation, mesure de la phosphorylation directe du récepteur dans les cellules, Phosphorylation In vitro, même méthode mais en dehors de la cellule; Physiologie, mesure du fonctionnement cardiaque; Séquestration, étude de l'internalisation du récepteur et Désensibilisation, mesure de la désensibilisation spécifique de chaque récepteur.


La phosphorylation du récepteur D1A de rat apparaît dès les premières secondes d'incubation avec l'agoniste et devient maximale après 5 minutes (Tiberi et al., 1996). La coexpression des protéines GRK2, 3 et 5 ne fait qu'augmenter cette phosphorylation. Dans ce cas, cette phosphorylation n'intervient que sur les résidus sérines du récepteur (Tiberi et al., 1996). Cette façon de réguler le fonctionnement des récepteurs n'est pas habituelle. En effet, on trouve communément des modifications dans le taux de phosphorylation des récepteurs comme dans le cas des récepteurs b-adrénergiques (Freedman et al., 1995; Kunapuli et al., 1994; Pei et al., 1994b). Dans le cas du récepteur D1A, le même taux de phosphorylation des récepteurs est obtenu quelle que soit la protéine GRK surexprimée, mais il existe des différences dans les conséquences biologiques de la désensibilisation en fonction de la nature des GRK. Ainsi, seule la présence de GRK5 permet de réduire de façon importante le niveau maximal de l'activation de l'adénylate cyclase. Ces résultats suggèrent que s'il n'y a pas de spécificité de phosphorylation parmi les GRK, elles peuvent produire des profils de désensibilisation différents en interagissant avec la réserve de protéines présente dans la cellule. Le contenu de chaque neurone et la région où il s'exprime peut donc influer sur la réponse de la cellule. Ainsi les ARNm des GRK2, 3 et 5 sont distribuésde façon différentielle dans le cerveau. Dans plusieurs aires cérébrales, les protéines GRK2 et 3 sont présentes en même temps que les récepteurs D1A (Arriza et al., 1992). De plus, la protéine GRK5 est exprimée dans le cortex et la rétine, deux zones où l'on retrouve également les récepteurs D1A (Didsbury et al., 1991; Premont et al., 1994). Des différences de désensibilisation pour les récepteurs D1 ont d'ailleurs été montrées dans ces régions, avec une désensibilisation plus forte dans la rétine que dans le cortex (Ofori et al., 1993), ce qui pourrait s'expliquer par ces différences dans la composition des voies de régulation. Toutefois, la présence exclusive des récepteurs D1 dans la rétine, alors que les récepteurs D1 et D2 sont exprimés dans le striatum est probablement la raison d'une capacité de stimulation de l'adénylate cyclase par la dopamine plus forte dans la rétine que dans le striatum.

Les sites de phosphorylation des récepteurs D1 par les GRK n'ont pas encore été identifiés, pour plusieurs raisons. Bien que des déductions aient été faites à partir des études de mutagenèse, l'identification claire de ces sites nécessite la purification et l'analyse biochimique des récepteurs (Diviani et al., 1997; Fredericks et al., 1996). Or, les récepteurs couplés aux protéines G sont particulièrement hydrophobes et souvent exprimés à de faibles taux, ce qui les rend très difficile à purifier. De plus, contrairement aux kinases PKA ou PKC, il est impossible d'obtenir les séquences «consensus» par simple comparaison. Enfin, les analyses in vitro ont bien montré l'existence de sites de phosphorylation potentiels, mais l'analyse in vivo indique que, selon le stimulus, ces sites de phosphorylation sont différents et surtout, différents des prédictions (Böhm et al., 1997). La phosphorylation des récepteurs par les GRK nécessite l'association de ces kinases avec les sous-unités bg des protéines G (Carman et al., 2000) et plus particulièrement avec le domaine PH des sous-unités b des protéines G (pour revue voir Daaka et al., 1997; Inglese et al., 1995). Toutefois, certaines expériences contredisent ces observations et montrent au contraire que lorsque l'on supprime l'isoprénylation de la sous-unité g, ce qui induit la redistribution de bg dans le cytoplasme, on ne modifie pas la localisation de GRK2 (Murga et al., 1997). La protéine GRK2 est également capable de phosphoryler la tubuline ce qui indiquerait que cette kinase appartient à un complexe de signalisation qui n'est pas uniquement limité à la diminution du couplage des récepteurs couplés aux protéines G mais qui est associé à la signalisation vers le cytosquelette (Pitcher et al., 1998b). Approximativement 10 % des récepteurs couplés aux protéines G contiennent un motif PDZ (Tableau 6) que l'on retrouve aussi dans GRK3 et GRK6. La découverte de toutes ces interactions permet d'associer les GRK au «transducisome» capable de rassembler tous les acteurs de la régulation du signal.


c. Quelle est la part de toutes ces kinases régulatrices dans la désensibilisation ?

Les interactions précises entre les voies de régulation semblent encore une fois très dépendantes des systèmes cellulaires dans lesquels elles sont analysées. Ainsi, dans des cellules musculaires ou dans la lignée CHO, le récepteur b2-adrénergique est principalement désensibilisé par GRK2. Dans des ostéosarcomes de rat, c'est plutôt la PKA qui joue ce rôle. Dans des carcinomes épidermaux humains, les deux systèmes interviennent à égalité (Shih et Malbon, 1994). De même, des expériences effectuées sur le récepteur b2-adrénergique montrent que ces deux phénomènes de phosphorylation ont lieu lorsque le récepteur est activé par son ligand naturel dans une lignée fibroblastique de hamster chinois (CHW, Hausdorff et al., 1989). L'utilisation de différents mutant du récepteur dont les sites de phosphorylation ont été supprimés montre, qu'à de faibles concentrations (nanomolaire) de ligand, seule la PKA peut phosphoryler le récepteur alors qu'à de plus fortes concentrations (micromolaire) les deux types de kinases PKA et GRK agissent ensemble pour désensibiliser le récepteur.

Cette étape de phosphorylation semble l'évènement majeur qui conditionne l'efficacité de la désensibilisation. Les expériences effectuées sur des cultures cellulaires permettent de s'affranchir de la multiplicité d'expression des sous-types que l'on rencontre lors de l'utilisation de cultures primaires ou de tranches de cerveau. Dans le cas des récepteurs b-adrénergiques, quelques travaux ont suggéré que les sous-types de récepteur b1, b2 et b3 pouvaient être distingués sur la base de leurs propriétés de désensibilisation. Transfectés dans le même type cellulaire, les réponses à l’activation du récepteur b2 disparaissent plus vite et de façon plus intense que celles du récepteur b1. Le récepteur b3, est quant à lui, peu affecté par la désensibilisation. Ces propriétés fonctionnelles sont très bien corrélées avec le nombre et le type de motifs de séquences modifiés par phosphorylation (Marullo et al., 1995). Pour les récepteurs de la dopamine, il est observé que la désensibilisation des récepteurs D1 intervient dans les 30 premières minutes après la fixation d'un agoniste (Balmforth et al., 1990; Barton et Sibley, 1990). Une inactivation fonctionnelle est aussi observée pour le récepteur D2 dans des cellules de rétinoblastome Y-79 où le découplage fonctionnel et la baisse de la liaison spécifique du récepteur sont observés après traitement par un agoniste (Barton et al., 1991). En phosphorylant le récepteur, les protéines kinases modifient l'affinité de la région C-terminale du récepteur. Ainsi en retour, le récepteur passe dans un état de basse affinité pour la protéine G ce qui empêche toute activation par de nouvelles protéines G. De plus, l'affinité du récepteur augmente pour certaines autres protéines, dont les arrestines, qui stabilisent le récepteur dans cet état de basse affinité et facilite son internalisation (Ferguson et al., 1996).