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Analyse comparée des récepteurs D1 dopaminergiques chez les vertébrés.

Auteur : Dr. Stéphane LE CROM.   Site personnel : http://slecrom.free.fr


V. Régulation cellulaire des récepteurs D1 :

V.A. La désensibilisation des récepteurs D1 :

V.A.1. Les observations préliminaires

V.A.2. La première étape : le découpage fonctionnel

V.A.3. L'internalisation des récepteurs :

Les expériences effectuées avec les sous-types D1A et D1B montrent qu'après le découplage des récepteurs et des protéines G, une étape d'internalisation a lieu (pour une revue sur l'endocytose voir Cremona et De Camilli, 1997; Mukherjee et al., 1997). Ce phénomène est distinct dans le temps et dans l'espace de celui de la phosphorylation du récepteur comme le montre l'utilisation d'agents bloquants l'internalisation tels qu'un milieu riche en sucrose ou l'utilisation de concanavaline A (Ariano et al., 1997a; Jarvie et al., 1993; Ng et al., 1994; Ng et al., 1995). Dans tous les cas, ces agents bloquent l'endocytose sans empêcher la désensibilisation des récepteurs. Des études in vivo sur les neurones striataux de rat montrent que ce processus de désensibilisation a lieu pour les récepteurs D1 après injection d'amphétamine (Dumartin et al., 1998). Ainsi, après une injection intrapéritonéale d'un agoniste (SKF-82958), les récepteurs D1A dans le striatum subissent une importante redistribution intracellulaire. Le marquage membranaire diminue, avec une intensification du regroupement intracytoplasmique au niveau du corps cellulaire et des dendrites. Les vésicules marquées ressemblent à des endosomes et sont en plus grand nombre entre 20 et 40 minutes après l'injection. Aucun marquage ne semble associé aux lysosomes ni à l'appareil de Golgi ou au réticulum endoplasmique. L'injection du produit directement dans le striatum ne modifie pas ces phénomènes, et permet simplement de préciser la cinétique de leur apparition. Ainsi l'internalisation apparaît dès 4 minutes après l'injection et reste intense de 10 minutes à 1 heure après celle-ci (Dumartin et al., 1998), ce qui confirme les cinétiques observées in vitro.


a. L'internalisation par les vésicules recouvertes de clathrine :

La purification de vésicules recouvertes d'un manteau de clathrine, préparées à partir de striatum de bœuf, indique que les récepteurs D1 et D2 sont localisés avec les éléments de leurs cascades de transduction : protéines G et adénylate cyclase (Ozaki et al., 1994). Ces purifications montrent que l'internalisation de ces récepteurs se produit dans les vésicules recouvertes de clathrine. Cette endocytose pourrait être favorisée par une interaction directe entre l'arrestine et la clathrine (Goodman et al., 1996). En outre, la transfection conjointe de mutants dominants négatifs de la dynamine, protéine nécessaire à la formation de la vésicule, et d'un dominant négatif de l'arrestine bloque l'internalisation des récepteurs et leur régulation (Gagnon et al., 1998). Toutes ces expériences montrent que l'arrestine est impliquée dans une étape du processus d'internalisation. De plus, l'arrestine s'associe avec la protéine adaptatrice AP2 pour permettre l'assemblage de nouvelles vésicules recouvertes de clathrine (Laporte et al., 2000). C'est lors de la purification des GRK, que la perte de la capacité de désensibilisation, au cours des étapes de purification, a laissé penser à l'existence d'un cofacteur (Benovic et al., 1987). La fonction de ce cofacteur, l'arrestine, a été montrée, comme pour les GRK, par des expériences de surexpression (Tableau 13). Les arrestines ont un rôle important non seulement pour l'internalisation mais aussi pour le recyclage correct des récepteurs, puisque la surexpression de la b-arrestine 2 est capable de compenser la mutation du récepteur b2-adrénergique incapable de se resensibiliser (Zhang et al., 1997). La b-arrestine se trouve à la membrane sous une forme phosphorylée qui lui permet d'intervenir dans la désensibilisation et le découplage. Mais elle a besoin d'être déphosphorylée pour permettre l'endocytose des récepteurs (Lin et al., 1997). Les phosphinositols sont fondamentaux pour transférer le complexe recepteur/arrestine vers les puits couverts de clathrine (Gaidarov et al., 1999), et la séquestration des sous-unités bg des protéines G inhibe l'endocytose des récepteurs dans les vésicules à clathrine (Lin et al., 1998). Il semblerait donc que l'endocytose des récepteurs nécessite un mécanisme qui coordonne l'interaction entre plusieurs protéines : la dynamine, la clathrine et les protéines G pour permettre la fermeture de la vésicule d'endocytose (Achiriloaie et al., 1999). L'endocytose du récepteur b2-adrénergique nécessite la phosphorylation des tyrosines présentes dans la région C-terminale du récepteur (Valiquette et al., 1990). En effet, la mutation de deux tyrosines en C-terminal réduit de façon importante la diminution du nombre de récepteurs accessibles à la liaison radioactive.


Tableau 13 : Caractéristiques des membres de la famille des arrestines. La localisation a été effectuée par hybridation in situ. Abréviations : AR, récepteurs adrénergiques; AChR, récepteurs de l'acétylcholine; PKC, protéine kinase C.


b. Implication de la voie caveolaire :

Les mécanismes d'internalisation des récepteurs par les vésicules à cathrine ont été sujets à beaucoup de controverses. Si les récepteurs b2-adrénergiques voient leur séquestration diminuée en présence d'un mutant dominant négatif de la dynamine, ce n'est pas le cas des récepteurs AT1A de l'angiotensine II (Zhang et al., 1996). Ces effets sont mesurés par la diminution de la quantité de récepteurs accessibles aux anticorps à la surface de la cellule. De plus, l'utilisation d'un mutant dominant négatif de la b-arrestine montre la même différence puisque seule l'internalisation des récepteurs b2-adrénergiques est affectée. Si une majorité des études sur l'internalisation décrit les vésicules recouvertes de clathrine comme la voie principale d'endocytose durant la désensibilisation, d'autres observations sont contradictoires. Après traitement à l'isoprotérénol sur des cellules de carcinomes (A431), les récepteurs b2-adrénergiques sont observés en microscopie électronique, dans des vésicules d'endocytose sans clathrine, ce qui suggère une internalisation via les caveolae (Raposo et al., 1989). Ces analyses sont contradictoires avec les travaux de l'équipe de von Zastrow qui montre que l'endocytose du récepteur b2 a bien lieu dans des vésicules à clathrine mais qui diffèrent fonctionnellement des vésicules classiques comme celles qui contiennent des récepteurs de la transférrine (Cao et al., 1998). Plusieurs récepteurs couplés aux protéines G sont dirigés vers les caveolae, par semble-t-il, deux types de mécanismes (pour revue voir Anderson, 1998; Okamoto et al., 1998). Après contact avec l'agoniste, les récepteurs comme le récepteur M2 muscarinique de l'acétylcholine (Feron et al., 1997), les récepteurs de la bradykinine (De Weerd et Leeb-Lundberg, 1997) ou de l'endothéline (Chun et al., 1994) et les récepteurs b-adrénergiques (Dupree et al., 1993) se déplacent vers les caveolae, où ils retrouvent tout l'environnement nécessaire à la transduction du signal. Dans cette voie, les caveolines pourraient jouer un rôle similaire à celui des protéines à domaine PDZ pour créer un «échafaudage» contenant tous les effecteurs nécessaires à la transduction rapide du signal (Figure 16). L'autre processus possible concerne les récepteurs qui sont déjà localisés dans les caveolae à l'état de repos. La liaison du ligand sur ces récepteurs s'effectue donc dans les caveolae où le récepteur est déjà asocié à son module de transduction, prêt à être activé efficacement. Ainsi, dans les cardiomyocytes ventriculaires de rat, le récepteur A1 est isolé dans les caveolae à 67% (Lasley et al., 2000).


c. Quelle est la part relative de chacune de ces voies dans l'endocytose ?

Ces deux voies d'endocytose dans les vésicules à clathrine ou les caveolae sont observées pour les récepteurs b-adrénergiques après la fixation du ligand, et ces deux mécanismes ont été analysés dans les mêmes cellules pour les récepteurs de la cholecystokinine de type A (Roettger et al., 1995 et Figure 20).

Dans ces travaux, la voie cavéolaire semble avoir un rôle dans la désensibilisation à court terme et le recyclage dans les endosomes proches de la membrane plasmique. Par contre, les puits recouverts de clathrine, semblent correspondre à la voie prédominante pour la désensibilisation à long terme qui nécessite un passage dans des endosomes tardifs et les lysosomes. Les analyses effectuées dans les cellules CHO pourraient indiquer que la voie des caveloae est plus particulièrement impliquée dans le recyclage rapide des récepteurs à la membrane, alors que la voie d'endocytose via la clathrine est impliquée plus particulièrement dans la régulation à long terme qui aboutit à la dégradation des récepteurs. Ces expériences effectuées en lignée stable sont assez convainquantes car elles comportent non seulement des observations en microscopie à fluorescence, mais aussi des observations en microscopie électronique. De plus, l'utilisation de sondes peptidiques fluorescentes et l'emploi de certains inhibiteurs de la voie de la clathrine permet d'avoir une bonne idée de la part respective de chacune des voies dans l'endocytose des récepteurs lors de la désensibilisation. Il semble donc qu'au maximum 40% des récepteurs soient capables d'emprunter la voie des caveolae. L'observation des mécanismes intervenant dans l'endocytose sur un seul type de neurone n'a pas permis de bien séparer les voies de la clathrine, des voies cavéolaires (Rankin et al., 1999). La recherche par western blot et immunoprécipitation des acteurs de l'internalisation des récepteurs couplés aux protéines G a permis de détecter la protéine GRK2, une b-arrestine, la clathrine et la dynamine. A l'aide du marqueur FM1-43 l'internalisation des récepteurs olfactifs est observée au bout de 45 minutes et le mécanisme semble dépendre de la clathrine. En effet, le traitement à l'acide okadaique qui active la voie caveolaire ne donne pas de résultats clairs. Il semble bien difficile aujourd'hui de comprendre l'intervention exacte des caveolae dans l'internalisation des récepteurs lors de la désensibilisation.



Figure 20 : Internalisation de la cholécystokinine (CCK) couplée à des billes d'or dans des cellules CHO exprimant de façon stable les récepteurs de la CCK (d'après Roettger et al., 1995). A. et B. Les cellules sont préincubées avec la CCK couplée aux billes d'or pendant une heure à 4°C puis réchauffées à 37°C avant l'observation au microscope électronique. C. Effet de l'inhibition de l'endocytose par la voie de la clathrine (par déplétion en potassium). Le marquage à l'or se retrouve exclusivement dans les puits non recouverts. La barre représente 200 mm.



De nombreuses molécules de la signalisation sont localisées dans les puits membranaires caveolaires tels que les sous-unités a et b des protéines G ou l'adénylate cyclase (Huang et al., 1997). Ce qui semble indiquer que l'endocytose par ces vésicules faciliterait le couplage des récepteurs. De plus, une fois activée, la sous-unité Ga des protéines G reste agrégée à la membrane et ne se retrouve pas libérée dans le cytoplasme (Huang et al., 1999). L'observation de cellules de neuroblastomes Neuro2A coexprimant les récepteurs D1A et D2 humain portant chacun des étiquettes différentes montre que si le récepteur D1 se localise bien à la membrane, le récepteur D2 se localise dans des vésicules et semble sujet à une endocytose constitutive (Vickery et von Zastrow, 1999). Après activation par la dopamine, l'internalisation, observée par marquage avec un anticorps sur des cellules intactes, s'effectue dans des vésicules différentes. Cette particularité n'est pas unique aux cellules neuronales puisqu'on la retrouve dans les cellules HEK 293 exprimant les récepteurs de façon stable. L'internalisation est rapide dans les 10 minutes après stimulation par la dopamine et atteint 70 % de la réserve de récepteurs par rapport à l'état de base avec moins de 5% d'internalisation sans activation. Par contre, on observe 25% d'internalisation continue pour le récepteur D2. La cotransfection d'un mutant dominant négatif de la dynamine inhibe l'internalisation du récepteur D1A mais pas celle du récepteur D2. Cependant, des expériences récentes ont montré que les mutants dominant négatif de la dynamine utilisés jusqu'à maintenant n'inhibait pas complétement l'internalisation par les voies dépendantes de la clathrine (Werbonat et al., 2000). En plus de cette différence d'internalisation D1A/D2, on ne remarque pas de colocalisation entre les récepteurs D1A et D2 dans les vésicules d'endocytose.

Des expériences du même type ont été conduites pour les récepteurs de l'angiotensine II. Après un traitement à l'angiotensine II, seul le sous-type AT1A est internalisé alors que le sous-type AT2 ne l'est pas ([Hein, 1997 #201Ces différences sont visibles dans une grande variété de types cellulaires (pour revue voir Hunyady, 1999). Enfin, des résultats similaires sont observés avec les sous-types de récepteur a2-adrénergiques (Daunt et al., 1997). Après activation par le ligand, le sous-type a2A ne semble pas s'internaliser, alors que le récepteur a2B possède un profil de désensibilisation et d'internalisation proche du récepteur b2-adrénergique. Pour le sous-type a2c par contre, la situation est plus compliquée parce qu'une large partie du récepteur est située dans des compartiments intracellulaires dans le réticulum endoplasmique.

Dans tous ces phénomènes, la formation de complexes multi-moléculaires dans lesquels tous les éléments de la cascade de transduction sont en contact est l'événement essentiel. La protéine arrestine apparaît donc plus comme une molécule d'«échafaudage» capable de recruter à la membrane les différents régulateurs de l'endocytose des récepteurs. Cependant l'arrestine ne semble pas être la seule molécule capable de ce type de mobilisation. Les GRK contiennent également un domaine PDZ. Ainsi, la protéine EBP50 (Ezrin-radixin-moesin Binding Protein-50) se lie à GRK5 pour faciliter l'endocytose des récepteurs b2-adrénergiques dans les cellules HEK 293 (Cao et al., 1999). La phosphorylation de la sérine 411 du récepteur b2-adrénergique par la kinase GRK5 est nécessaire à l'interaction de la protéine EBP50 et permet le recyclage du récepteur.

Grâce à toutes ces interactions, il serait possible d'orienter le récepteur vers les voies de recyclage plutôt que vers celles de la dégradation. En plus de cette interaction avec la protéine EBP50 dans la région C-terminale, le récepteur b2-adrénergique peut aussi interagir avec l'actine du cytosquelette sous membranaire par un domaine ERM (Ezrin-radixin-moesin, pour revue voir Tsukita et al., 1997). Là encore, la multiplicité des interactions potentielles entre protéines nécessite d'étudier l'endocytose dans un contexte cellulaire précis.


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