Troisième partie - La sortiline ou NTSR3, une protéine aux multiples facettes ?


3 - Localisation subcellulaire du NTSR3 :

Figure 16

Le NTSR3 présente une localisation majoritairement intracellulaire (90 %) principalement au niveau de l'appareil de Golgi et du réseau trans-golgien (Figure 16). Le reste de la protéine est localisé au niveau de la membrane plasmique où elle peut lier ses différents ligands extracellulaires.


4 - Propriétés de liaison - Pharmacologie :
La pharmacologie du NTSR3 se révèle d'une grande complexité du fait du nombre croissant de ligands différents qui s'avère capable de se lier au récepteur mais aussi de la présence d'un site de clivage par la furine qui permet, après maturation du NTSR3, une modification des propriétés de liaison du récepteur vis-à-vis de ses ligands. Les affinités obtenues vis-à-vis de ses agonistes dépendent aussi de la manière dont les expérimentations sont effectuées.


4-1 Par la technique du Biacore (résonance de surface) :
La technique du Biacore a permis la mise en évidence de plusieurs ligands du NTSR3. Cette technique nécessite d'une part de purifier la protéine d'intérêt ici, le NTSR3, et d'autre part, de la " greffer " sur des pastilles (sensor chips). Le passage d'un flux régulé de molécules à étudier sur ces pastilles va, s'il y a interaction entre le NTSR3 et la molécule testée, provoquer des variations de résonance magnétique dépendantes de l'affinité du récepteur pour la molécule. Petersen et al. ont montré à l'aide de cette technique que la RAP se liait de manière réversible et dépendante du pH au NTSR3, avec une affinité de liaison (Kd) de l'ordre de 40 nM. Cette liaison est inhibée spécifiquement par deux autres ligands du NTSR3 que sont la neurotensine et son propre propeptide (Munck Petersen et al., 1999). Dans ce système de mesure particulier, le NTSR3 présente un Kd pour la neurotensine inférieur à 20 nM (Munck Petersen et al., 1999).

Par cette même technique, Nielsen et al. ont mis en évidence un autre ligand du NTSR3, la Lipoprotéine Lipase (LpL). Dans ces conditions, l'affinité de la liaison de la LpL pour le NTSR3 est de 26 nM. Cette liaison est également déplacée par la neurotensine (Nielsen et al., 1999).


4-2 Sur homogénats solubilisés par le détergent CHAPS :
Initialement, le NTSR3 a été isolé à partir de cerveau humain solubilisé par un détergent non dénaturant, le CHAPS (Zsürger et al., 1994). Les propriétés de liaison du NTSR3 humain (hNTSR3) ont été déterminées après transfection transitoire de cellules COS avec l'ADNc codant pour le hNTSR3 et solubilisation des protéines par le détergent CHAPS (Mazella et al., 1998). La liaison de la NT est saturable et réversible avec une cinétique d'association très rapide (3-5 minutes). L'affinité apparente du hNTSR3 solubilisé pour la NT est de l'ordre de 10 à 30 nM, une valeur beaucoup plus élevée que celle obtenue sur cerveau solubilisé (0,1 à 0,3 nM). Mazella et al. ont montré que cette différence d'affinité était la conséquence d'une maturation différente du hNTSR3. En effet, la cotransfection dans les cellules COS de l'ADNc codant pour la furine avec celui codant pour le NTSR3 fait apparaître un nouveau site de liaison de plus haute affinité (0,3 nM) qui reflète, l'affinité de liaison de la forme maturée du hNTSR3 pour la NT (Mazella et al., 1998). Petersen et al. ont confirmé ce résultat dans une étude utilisant la technique du Biacore où ils démontrent que le clivage du propeptide par la furine est une condition nécessaire à la liaison de la neurotensine et de la RAP au récepteur (Munck Petersen et al., 1999).

Les analogues de la NT sont capables de déplacer la liaison de la NT au NTSR3 avec des constantes de demi-inhibition obtenues sur solubilisat de cerveau humain (Tableau 4) (Mazella et al., 1998). Cependant, il faut noter que la NT et la Trp11-NT ont la même affinité pour le hNTSR3 contrairement au récepteur humain purifié qui a une affinité dix fois meilleure pour la NT que pour la Trp¹¹-NT (Zsürger et al., 1994). De plus, la liaison de la NT au NTSR3 est insensible à la lévocabastine et au GTP.


Au laboratoire, j'ai personnellement participé au clonage du NTSR3 de souris (mNTSR3) par homologie avec le NTSR3 humain (Article 3). L'ADNc isolé (8,5 kb) code pour une protéine de 825 acides aminés dont la séquence protéique présente 95 % d'homologie avec le récepteur cloné chez le rat et 92 % avec le récepteur humain. La structure et la localisation subcellulaire du mNTSR3 sont identiques à celles observées pour le hNTSR3.

Article 3 : Valérie Navarro, Stéphane Martin, Philippe Sarret, Morten S. Nielsen, Claus M. Petersen, Jean-Pierre Vincent and Jean Mazella. Pharmacological properties of the mouse neurotensine receptor 3. Maintenance of cell surface receptor during internalization of neurotensin. (2001) FEBS Letters, 495 : 100-105.

Tableau 4

Les propriétés de liaison du mNTSR3 sont regroupées dans le Tableau 4. L'affinité apparente du mNTSR3 vis-à-vis de la NT est d'environ 40 nM que ce soit sur des cellules entières transfectées avec l'ADNc codant pour le mNTSR3 ou sur des extraits solubilisés à partir de ces mêmes cellules. Les valeurs retrouvées pour les analogues de la NT sont similaires à celles observées pour le récepteur humain (Tableau 4). Nous noterons toutefois la très mauvaise affinité apparente du mNTSR3 pour la neuromédine N et pour la D-Trp¹¹-NT (Kd>1 mM) qui étaient reconnues avec une meilleure affinité par l'homologue humain (respectivement 63 nM et 72 nM).