Troisième partie - La sortiline ou NTSR3, une protéine aux multiples facettes ?


5 - Internalisation, trafic intracellulaire du NTSR3 :


5-1 Internalisation


5-2 Trafic intracellulaire :
Nielsen et al. ont montré, en combinant les techniques de microscopies confocale et électronique, que la protéine chimérique IL2R-NTSR3-ct était, après internalisation à 37°C, associée à des puits tapissés de clathrine puis à des endosomes précoces et enfin avec le temps s'accumulait dans un compartiment périnucléaire TGN38 positif correspondant au réseau trans-golgien (Nielsen et al., 2001). De façon surprenante, la colocalisation de cette chimère avec les endosomes tardifs (Lamp-1 positif) est rare et ne s'observe que pour des temps longs d'incubation à 37°C (Nielsen et al., 2001). Il semble par conséquent que l'extrémité carboxy-terminale du hNTSR3 permette son endocytose par un mécanisme faisant intervenir les puits tapissés de clathrine dans un premier temps pour, dans un deuxième temps adresser les récepteurs au niveau du TGN via des endosomes Lamp-1 négatif.

Le trafic intracellulaire du NTSR3 exprimé de manière endogène dans des lignées de cellules établies est-il identique à celui observé pour un récepteur chimérique après transfection dans les cellules CHO ?

Pour répondre à cette question, en collaboration avec le laboratoire du Dr. Alain Beaudet (MNI, Montréal, Canada), nous nous sommes intéressés au trafic intracellulaire du hNTSR3 exprimé de manière endogène dans les cellules humaines de cancer de côlon HT29 (Article 4, soumis à publication). Deux des récepteurs de la neurotensine sont exprimés de manière endogène dans cette lignée cellulaire cancéreuses, le hNTSR1 et le hNTSR3. Les différents signaux intracellulaires faisant suite à la liaison de la neurotensine aux récepteurs présents à la surface de ces cellules (une augmentation de la synthèse des phospho-inositides, une activation de la voie des MAP kinases par un mécanisme faisant intervenir les protéines kinases C (PKC) ou encore une croissance cellulaire accrue) ont tous été attribués au NTSR1 (Amar et al., 1986 ; Bozou et al., 1989 ; Poinot-Chazel et al., 1996 ; Maoret et al., 1999). La découverte récente et le clonage du NTSR3 laissent penser que ces différents effets, initialement attribués au seul NTSR1, pourraient en partie dépendre ou tout du moins être modulés par ce nouveau type de récepteur. Ainsi, nous verrons par la suite, comment le NTSR3 peut agir sur la réponse neurotensinergique passant par le hNTS1 dans ces cellules HT29 (Article 6, voir plus bas).

Nous avons, dans un premier temps, étudié la localisation subcellulaire du hNTSR3 dans les cellules HT29 quiescentes en combinant les techniques de microscopies confocale et électronique et dans un second temps, nous avons étudié la redistribution subcellulaire du complexe NT-NTSR3 par fractionnement subcellulaire en fonction du temps d'exposition au ligand (Article 4).

Article 4 : Anne Morinville*, Stéphane Martin*, Mariette Houle, Jean-Pierre Vincent, Alain Beaudet and Jean Mazella. Internalization of neurotensin via NTS3 receptors in HT29 cells : trafficking to trans-Golgi and nuclear compartments. Soumis à publication. *contribution identique.

- Dans les cellules HT29 en absence de stimulation par la neurotensine :

Figure 19

Le NTSR3 présente dans les cellules HT29 quiescentes une distribution un peu différente de celle observée pour le récepteur cloné (Figure 19). Il est, tout comme pour le récepteur cloné, principalement retrouvé au niveau d'un compartiment périnucléaire de type Golgi/TGN et est également présent au niveau de la surface cellulaire (Figure 19 A-C). Aucune colocalisation entre les récepteurs et les compartiments lysosomiaux n'a pu être mis en évidence (Figure 19-D).

Figure 20

La localisation du NTSR3 a été confirmée par microscopie électronique où l'immunoréactivité NTSR3, bien que présente à la membrane plasmique (10,3 %) est majoritairement intracytoplasmique (56,9 %) associée aux citernes de l'appareil de Golgi et aux membranes de nombreuses vésicules de forme et de taille variables (Figure 20 B-D). De manière surprenante, le NTSR3 est présent au niveau du noyau des cellules HT29 dans une proportion non négligeable puisqu'elle représente 4,8 % et 28 % des récepteurs totaux respectivement au niveau de la membrane nucléaire et du nucléoplasme.

- Dans les cellules HT29 stimulées par la neurotensine :
La stimulation par le ligand ne modifie pas la quantité de récepteur membranaire ce qui est en accord avec nos précédentes observations (Article 3, Navarro et al., 2001) et qui implique une fois encore, un recyclage rapide des récepteurs internalisés vers la surface cellulaire ou bien l'apparition régulée d'un nouveau pool de récepteurs à partir d'un compartiment intracellulaire.

Figure 21

Le marquage immunologique des récepteurs présents à la surface cellulaire et l'utilisation d'un analogue fluorescent de la neurotensine nous ont permis de déterminer le trafic intracellulaire du ligand et du récepteur dans les cellules HT29 (Figure 21). La neurotensine est en partie internalisée par le NTSR3 initialement présent à la surface cellulaire des cellules HT29 (Figure 21-D). Cette endocytose est totalement prévenue par l'utilisation du saccharose ce qui indique que le processus fait intervenir les puits tapissés de clathrine. Après 30 min, une quantité non négligeable de peptide fluorescent se retrouve dans le noyau (Figure 21-A). Au cours de mes travaux de thèse, j'ai également étudié le trafic intracellulaire du NTSR3 humain après transfection dans les cellules COS. Dans ces cellules, la NT fluorescente est internalisée par le NTSR3 et se retrouve rapidement et de manière intéressante, tout comme dans les cellules HT29, au niveau du compartiment nucléaire (Figure 21-B, résultats personnels non publiés). Il faut noter que ce profil de localisation nucléaire de la NT internalisée n'a jamais été observé avec des cellules transfectées par les ADNc codant pour le NTSR1 ou pour le NTSR2.

Dans les cellules HT29, le NTSR3 de surface (mis en évidence par pré-incubation des cellules à 4°C avec l'anticorps anti-NTSR3) est internalisé en présence du ligand et se retrouve concentré dans un compartiment transferrine positif qui reflète la voie classique d'internalisation par les puits tapissés de clathrine (Figure 21-C). Le complexe récepteur-anticorps est partiellement retrouvé au niveau du réseau trans-golgien, de l'appareil de Golgi et des lysosomes (Figure 21 E-G). Il est intéressant de constater que les complexes anticorps-récepteurs sont toujours très concentrés dans le compartiment de recyclage (transferrine positif), même après 40 minutes d'incubation à 37°C en présence de neurotensine (Figure 21-C).

Figure 22

Afin d'aller plus avant dans la caractérisation du trafic intracellulaire de ce récepteur dans les cellules HT29, nous avons utilisé un analogue iodé photoactivable de la NT, l'azido-¹²⁵I-Tyr³-NT(2-13). Ainsi, pour suivre le devenir du complexe NT-NTSR3, nous avons incubé les cellules HT29 pendant différents temps avec ce traceur radioactif et fixé la NT de manière covalente aux récepteurs par irradiation des cellules aux UV. Les cellules sont ensuite lysées, les différents composants cellulaires sont séparés par un fractionnement subcellulaire et les complexes NT-NTSR3 sont révélés par autoradiographie (Figure 22). Comme le montre la figure 22-A, le NTSR3 existe sous deux formes de poids moléculaires différents, une forme membranaire de 135 kDa (minoritaire), et une forme intracellulaire de 105 kDa (majoritaire) qui correspondent à deux états différents de glycosylation (voir article 6). Les récepteurs fortement glycosylés (135 kDa) représentent les récepteurs présents au niveau de la surface cellulaire des cellules HT29 (Figure 22-A).

Le complexe covalent formé entre l'azido-NT et le NTSR3 de haut poids moléculaire est majoritaire dans la fraction membranaire (Figure 22 B-C). Ceci est en accord avec le fait que le récepteur de haut poids moléculaire soit principalement membranaire (Figure 22-A). Dans la fraction HDM (High Density Microsomes : fraction Rab-5 positive), qui correspond aux compartiments précoces de l'endocytose, on retrouve une proportion identique de complexe NT-NTSR3 de haut et bas poids moléculaires (Figure 22 B-C). Dans la fraction LDM (Low Density Microsomes : fraction syntaxine-6 positive) qui représente un compartiment subcellulaire situé en aval de celui des endosomes précoces, seul le complexe NT-NTSR3 de bas poids moléculaire est observé (Figure 22 B-C). Ces résultats semblent indiquer qu'un transfert de la NT iodée s'opère, au niveau du compartiment représenté par les fractions HDM, de la forme de 135 kDa (NTSR3 membranaire) vers la forme de 105 kDa (NTSR3 intracellulaire).

Par microscopie confocale, nous avons vu que le complexe anticorps-NTSR3 venant de la surface était presque exclusivement retrouvé au niveau du compartiment de recyclage transferrine positif et très faiblement associé au Golgi, au TGN ou encore au compartiment lysosomial. Le ligand, quant à lui, progresse inévitablement jusqu'au noyau (Figure 21-A). Cependant, à aucun moment, nous n'avons pu observer de complexes Fluo-NT-NTSR3 dans le noyau et l'on peut alors se demander par quel mécanisme le peptide parvient au noyau. Toutefois, le NTSR3 est bien présent dans le compartiment nucléaire (Figure 20-A) suggérant ainsi un rôle fonctionnel de ce récepteur à ce niveau dans les cellules HT29.

Si le NTSR3 est responsable de ce transport, cela implique la mise en place par la cellule, d'un mécanisme de clivage du récepteur en amont de son domaine hydrophobe transmembranaire au niveau de la membrane nucléaire. Il ne faut toutefois pas oublier que ces cellules expriment un autre type de récepteur de la neurotensine, le NTSR1. Ce récepteur est internalisé en présence de ligand mais à aucun moment ne se retrouve dans le compartiment nucléaire (Vandenbulcke et al., 2000). De plus, la NT n'a jamais été retrouvée dans le noyau de cellules exprimant le NTSR1 seul contrairement aux cellules COS transfectées par l'ADNc codant pour le NTSR3 humain dans lesquelles une quantité non négligeable de peptide internalisé est retrouvé dans ce compartiment (Figure 21-B). Il semble donc improbable que le NTSR1, dans les cellules HT29, soit responsable du transport de la neurotensine au noyau. Cependant, le fait que le NTSR1 adresse la neurotensine au niveau du réseau trans-golgien (Vandenbulcke et al., 2000) laisse imaginer un mécanisme par lequel le peptide libéré au niveau de ce compartiment serait pris en charge par le NTSR3 de bas poids moléculaire, présent en quantité dans le TGN, pour ensuite être adressé dans le compartiment nucléaire.

Figure 23

Aux vues de ces différents résultats et en se basant sur les données de la littérature concernant le trafic intracellulaire du NTSR1 d'une part et du NTSR3 d'autre part, nous pouvons proposer un modèle hypothétique concernant le trafic intracellulaire du complexe NT-NTSR3 dans les cellules HT29. Ce modèle pourrait expliquer à la fois la localisation majoritairement intracellulaire du NTSR3 et le fait que la neurotensine internalisée se retrouve au niveau du noyau (Figure 23).