Troisième partie - La sortiline ou NTSR3, une protéine aux multiples facettes ?


5 - Internalisation, trafic intracellulaire du NTSR3 :
Nous venons de voir que le NTSR3 était localisé de manière préférentielle au niveau intracellulaire mais le fait que les cellules transfectées avec l'ADNc codant pour le NTSR3 (humain ou murin) présentent une activité de liaison NT aisément détectable indique que le récepteur est en partie exprimé à la membrane. Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons à l'internalisation du NTSR3, aux motifs impliqués dans ce processus mais aussi au trafic intracellulaire qui suit son endocytose.


5-1 Internalisation :
Au laboratoire, nous avons montré que le mNTSR3 présent à la surface cellulaire liait la NT et l'internalisait (environ 70 % de la liaison totale) avec une cinétique rapide (T1/2 = 10 min), dépendant de la température. Ce mécanisme peut être inhibé par le saccharose, un agent bloquant l'internalisation passant par les puits tapissés de clathrine (Article 3 : Navarro et al., 2001). De plus et de manière très surprenante, la quantité de mNTSR3 présente à la surface cellulaire augmente très légèrement au cours du temps d'incubation avec le peptide. Le fait que le taux de mNTSR3 membranaire ne diminue pas en présence du peptide peut s'expliquer de deux manières. Le NTSR3 pourrait être rapidement recyclé après internalisation du peptide et ainsi expliquer pourquoi la quantité de récepteur reste constante à la membrane plasmique. Il se peut également que l'internalisation du complexe NT-NTSR3 constitue un signal au niveau intracellulaire conduisant à l'adressage d'un pool de récepteurs dit " de réserve " depuis un compartiment intracellulaire vers la membrane plasmique. Un tel mécanisme d'apparition de nouveaux sites à la surface cellulaire avait été avancé il y a quelques années dans une étude réalisée par Chabry et al. qui montrait que l'internalisation de la NT sur des neurones de souris en culture primaire entraînait l'apparition d'un nouveau site de liaison pour la NT dont on sait aujourd'hui qu'il correspond au NTSR3 (Chabry et al., 1993).

Le NTSR3 peut également internaliser un autre de ses ligands, la Lipoprotéine Lipase (LpL). En effet, l'étude réalisée par Nielsen et al. indique que la LpL est internalisée par le hNTSR3 à la fois dans des cellules CHO transfectées avec l'ADNc codant pour le NTSR3 mais aussi dans une lignée adipocytaire, les cellules 3T3-L1 (Nielsen et al., 1999).

Comme nous l'avons détaillé précédemment, le NTSR3 présente au niveau de son extrémité carboxy-terminale, une structure comparable à celle du récepteur au mannose-6 phosphate indépendant des cations, le MPR (Figure 17-A). Les travaux réalisés sur ce récepteur ont apporté des informations importantes pour la découverte rapide des sites responsables de l'internalisation du NTSR3.

Figure 17

Par mutagenèse dirigée de l'extrémité carboxy-terminale du NTSR3 humain, Nielsen et al. ont déterminé la séquence de résidus importante pour l'endocytose constitutive du récepteur. Pour ce faire, des constructions codant pour des protéines chimériques formées à partir de l'extrémité extracellulaire et du domaine transmembranaire du récepteur de l'interleukine 2 (IL2R) avec l'extrémité intracytoplasmique sauvage (IL2R-NTSR3-ct, Figure 17-A) ou muté du hNTSR3 ont été transfectées dans les cellules CHO. L'incubation de ces cellules avec un anticorps dirigé contre la partie extracellulaire (IL2R) a permis de suivre le trafic intracellulaire des récepteurs chimériques sauvage ou mutés en carboxy-terminal (NTSR3-ct) et de déterminer les séquences importantes pour l'internalisation du NTSR3 (Figure 17). Ainsi, comme il est indiqué dans la figure 17, le motif Tyr¹⁴-Ser-Val-Leu¹⁷ et le doublet Leu⁵¹-Leu⁵² sont conjointement associés au processus d'endocytose du hNTSR3 (Nielsen et al., 2001). La mutation de ces séquences en alanine a pour effet d'abolir l'internalisation du récepteur (Figure 17-B). De plus, ces mêmes mutations induisent une accumulation importante de récepteurs au niveau de la surface cellulaire (Figure 17-B).

La séquence Tyr-X-X-Leu, correspondant à la séquence consensus Tyr-X-X-F ou F représente un résidu hydrophobe, a déjà été mise en évidence comme étant un signal d'internalisation pour de nombreux récepteurs comme pour le récepteur du mannose-6 phosphate (MPR) (Canfield et al., 1991 ; pour revue, Hille-Rehfeld, 1995). De même, la présence d'un doublet de leucine dans l'extrémité carboxy-terminale d'un récepteur peut être à l'origine de son endocytose (pour revue, Le Borgne et Hoflack, 1998a). C'est aussi le cas pour le MPR qui, tout comme le NTSR3, a besoin de ces deux séquences pour une endocytose efficace (Canfield et al., 1991 ; Johnson et Kornfeld, 1992).

Il faut également noter la présence d'une séquence de résidus acides dans l'extrémité intracytoplasmique du NTSR3. Une séquence homologue est également présente dans le récepteur au mannose-6 phosphate (Figure 17-A). Ce motif (DDS⁴⁷DED⁵⁰) correspond à un site de phosphorylation par la caséine kinase II (CKII). En effet, le NTSR3 est phosphorylé sur la sérine de ce groupement acide in vitro par la CKII. Néanmoins, la délétion de ce groupement de résidus acides n'altère pas les paramètres d'internalisation du hNTSR3 (Nielsen et al., 2001).

Figure 18

Ce groupement acide, phosphorylable par la CKII, est aussi présent au niveau du domaine intracytoplasmique de la furine. La furine est internalisée par un processus identique à celui du NTSR3 (sensible aux concentrations hyperosmolaires de saccharose) et se retrouve au niveau du réseau trans-golgien par l'intermédiaire d'un mécanisme qui fait intervenir une protéine cytosolique appelé PACS-1 (Wan et al., 1998). Molloy et al. ont par ailleurs montré que la phosphorylation de la furine était nécessaire pour son endocytose (Figure 18). La furine, phosphorylée sur le groupement acide par la CKII, se retrouve dans le compartiment endosomal précoce et effectue des allers - retours entre ce compartiment et la surface cellulaire en fonction de son niveau de phosphorylation par un mécanisme faisant intervenir PACS-1 (Molloy et al., 1998). PACS-1 se lie également au groupement acide phosphorylé par la CKII de la furine au niveau des endosomes précoces. Cette interaction induit le transport de la furine des endosomes précoces au TGN (Figure 18). La déphosphorylation du groupement acide au niveau du réseau trans-golgien permet le recyclage de la furine vers les endosomes précoces par un mécanisme indépendant de la protéine PACS-1 (Wan et al., 1998). La combinaison de ces deux mécanismes permet de comprendre comment une protéine peut, suivant son état de phosphorylation, être adressée puis concentrée au niveau d'un compartiment spécifique, ici le TGN pour la furine.

Le NTSR3, comme nous l'avons détaillé précédemment, présente dans son extrémité intracytoplasmique, un domaine riche en résidus acides, identique à celui de la furine. Cette séquence peut être phosphorylé in vitro par la CKII et peut alors interagir avec la protéine PACS-1 (Nielsen et al., 2001). Cette interaction entre PACS-1 et l'extrémité carboxy-terminale du NTSR3 pourrait tout à fait rendre compte de la localisation particulière de ce récepteur au niveau du réseau trans-golgien.


5-2 Trafic intracellulaire