Troisième partie - La sortiline ou NTSR3, une protéine aux multiples facettes ?


6 - Le NTSR3, une protéine aux multiples fonctions ?
Le NTSR3, comme nous l'avons détaillé précédemment, peut lier plusieurs ligands et présente une localisation majoritairement intracellulaire au niveau du réseau trans-golgien et de l'appareil de Golgi. Ces caractéristiques permettent de poser des hypothèses quant à la fonction de ce récepteur au sein de la cellule. Le NTSR3 pourrait assurer une fonction de récepteur dit de " sorting " pour adresser certaines protéines du TGN aux endosomes puis aux lysosomes ou bien une fonction de " scavenger ", pour débarrasser le milieu extracellulaire en ligand (NT, LpL). Il pourrait également aider au transport de ces ligands en cours de synthèse en direction du milieu extracellulaire ou encore jouer une fonction de récepteur au niveau de la surface cellulaire et ainsi transmettre une information à l'intérieur du cytoplasme de la cellule. Dans les paragraphes suivants, nous détaillerons les travaux réalisés par l'équipe du Dr. Petersen au Danemark mais aussi nos propres résultats dans le but de répondre aux différentes hypothèses concernant la (ou les) fonction(s) cellulaire(s) du NTSR3.

6-1 Rôle du NTSR3 dans l'adressage des protéines aux endosomes :

Figure 24

L'appareil de Golgi et le réseau trans-golgien ont pour fonction première de maturer les protéines nouvellement synthétisées. Ces compartiments sont également le siège du tri des protéines à destination membranaire, lysosomiale ou qui doivent être sécrétées dans le milieu extracellulaire. C'est au niveau du TGN que les enzymes lysosomiales sont adressées vers les endosomes puis vers les lysosomes (Figure 24). Cette étape dépend de récepteurs à un seul domaine transmembranaire qui renferment dans leur extrémité intracytoplasmique des motifs responsables de ce transport (pour revue, Dell'Angelica et Payne, 2001). Dans les cellules de mammifère, ce processus est médié, pour les enzymes lysosomiales présentant des résidus de mannose 6-phosphate, par les récepteurs du mannose 6-phosphate (MPR) alors que chez la levure, cette fonction est assurée, pour la carboxypeptidase Y (CPY), par un récepteur appelé Vps10p (Marcusson et al., 1994). Dans leurs cellules respectives, les récepteurs MPR et Vps10p conduisent, en association avec de nombreuses protéines, leurs ligands du TGN aux compartiments prélysosomiaux (compartiments respectivement appelés endosomes chez les cellules de mammifères et prévacuoles chez la levure). Ces ligands sont ensuite adressés aux lysosomes pour les cellules de mammifères et aux vacuoles pour la levure alors que les récepteurs MPR et Vps10p sont recyclés vers le TGN (Figure 24). Ces deux types de récepteurs ne présentent pourtant pas d'homologie de séquence mais assurent des fonctions similaires au sein de leurs cellules respectives.

6-1-1 Adressage chez la levure :

Figure 25

Les enzymes vacuolaires se lient au domaine intravésiculaire du récepteur de la carboxypeptidase Y (Vps10p) au niveau du TGN dans des vésicules tapissées de clathrine pour être transportées aux vacuoles (Marcusson et al., 1994 ; Deloche et al., 2001). Le recyclage du récepteur Vps10p des endosomes vers l'appareil de Golgi nécessite l'intervention de nombreuses autres protéines qui, avec le Vps10p, forment un complexe protéique appelé rétromère (Figure 25) (Seaman et al., 1998). C'est au niveau de l'extrémité intracytoplasmique du récepteur Vps10p que se situent les sites responsables du processus de recyclage de ce récepteur des pré-vacuoles vers le réseau trans-golgien (Figure 26).


6-1-2 Adressage dans les cellules de mammifères :

Figure 26

Les enzymes lysosomiales (portant des motifs mannose 6-phosphate) présentes au niveau du TGN sont adressées vers les compartiments endosomiaux puis lysosomiaux par l'intermédiaire des récepteurs du mannose-6 phosphate (MPR) (pour revue, Le Borgne et Hoflack, 1998b). Les motifs responsables de ce transport du réseau trans-golgien vers les endosomes sont présents au niveau de l'extrémité intracytoplasmique des récepteurs MPR (Figure 26). Le recyclage de ces récepteurs des endosomes au TGN requiert l'intervention d'une protéine appelée TIP47 (Diaz et Pfeffer, 1998). De nombreuses études ont par ailleurs récemment démontré que les cellules de mammifère ont développé de multiples voies, distinctes les unes des autres, pour assurer le transport des protéines des compartiments endosomiaux au TGN (pour revue, Pfeffer, 2001).

Les protéines homologues à celles composant le rétromère chez la levure ont récemment été clonées chez l'humain et chez la souris mais aucune fonction ne leur a encore été attribuée (Edgar et Polak, 2000). De même, l'homologue du récepteur au mannose-6 phosphate a été cloné chez la levure. Cette protéine (Mrl1p) contribue conjointement avec le récepteur Vps10p au transport des enzymes de dégradation aux vacuoles (Whyte et Munro, 2001).

Comme on peut le remarquer sur la figure 26, le NTSR3 présente dans sa séquence carboxy-terminale un motif composé de résidus acides homologue à celui retrouvé dans le récepteur Vps10p et identique à celui du récepteur MPR. Comme nous l'avons vu précédemment, ce motif n'est pas responsable de l'internalisation du NTSR3 (voir ci-dessus, paragraphe 5-1). En revanche, Nielsen et al. ont montré que ces résidus acides pouvaient être, tout comme ceux présents au niveau du MPR, responsables du transport de protéines du TGN aux endosomes (Nielsen et al., 2001). En effet, ces derniers ont démontré qu'une chimère formée entre le domaine extracellulaire du récepteur MPR (comprenant le site de liaison des résidus de mannose-6 phosphate) et l'extrémité carboxy-terminale du NTSR3 transportait la b-hexosaminidase et la b-glucuronidase (deux enzymes lysosomiales présentant des motifs mannose-6 phosphate) du TGN aux lysosomes aussi efficacement que le récepteur MPR sauvage. Les mutations successives de l'extrémité carboxy-terminale de cette chimère (NTSR3) ont permis à Nielsen et al. de définir que le motif dileucine (Figure 26) était majoritairement responsable du transport de ces protéines du réseau trans-golgien aux lysosomes (Nielsen et al., 2001).

Figure 27

Au cours de ce même travail, Nielsen et al. ont montré une interaction entre le motif dileucine de l'extrémité intracytoplasmique du NTSR3 avec une protéine cytosolique appelée GGA2 (Golgi-localizing, Gamma-adaptin ear homology domain, ARF interacting protein). Les protéines de la famille GGA (GGA 1 à 3) ont été clonées récemment chez la levure et dans les cellules de mammifères par des laboratoires qui étudiaient différents aspects du trafic intracellulaire (Boman et al., 2000 ; Dell'Angelica et al., 2000 ; Hirst et al., 2000 ; Poussu et al., 2000). Ces protéines sont concentrées au niveau du réseau trans-golgien à la fois dans les cellules de mammifères et chez la levure (Boman et al., 2000 ; Dell'Angelica et al., 2000). Elles présentent une structure de base commune renfermant trois domaines qui assurent chacun une fonction distincte (Figure 27). Ainsi, les protéines de la famille GGA recrutent des molécules de clathrine au niveau d'une région centrale flexible reliant le domaine GAT (GGA and Tom1) de liaison pour les petites protéines-G de la famille ARF (ADP-Ribosylation Factor) qui aident à la régulation de la formation des vésicules et le domaine carboxy-terminal GAE (Gamma-Adaptin Ear homology domain). Le domaine VHS (Vps27/Hrs/STAM) quant à lui, permet des interactions avec d'autres protéines (MPR, NTSR3) (Figure 27). Les protéines de la famille GGA semblent jouer un rôle important dans le trafic intracellulaire en facilitant la formation des vésicules de clathrine au niveau du TGN d'une part et en aidant d'autre part au recrutement des protéines dont l'adressage doit se faire du réseau trans-golgien aux endosomes (pour revues, Boman, 2001 ; Black et Pelham, 2001).

Très récemment, Takatsu et al. ont montré que le motif dileucine de l'extrémité carboxy-terminale du NTSR3 pouvait interagir avec GGA1 (Takatsu et al., 2001). La mutation de ces deux résidus en alanine empêche l'interaction du NTSR3 avec GGA1 ce qui conduit à une localisation intracellulaire du NTSR3 au niveau des endosomes précoces, localisation différente de celle observée pour le récepteur sauvage qui se situe principalement dans le TGN. Cette différence de localisation intracellulaire a également été observée pour le récepteur du mannose 6-phosphate (MPR) muté sur ces deux mêmes résidus (Takatsu et al., 2001). Il semble par conséquent, que la protéine cytosolique GGA1 ait une importance fonctionnelle dans la localisation subcellulaire de ces récepteurs (NTSR3 et MPR) au niveau du réseau trans-golgien.

Dans cette partie, nous avons vu que le NTSR3, de part sa structure, sa localisation sub-cellulaire et ses partenaires protéiques, possédait, sans nul doute, un rôle de récepteur de d'adressage des protéines du réseau trans-golgien vers les endosomes. Cependant, il faut noter que ces travaux ont tous été réalisés avec des récepteurs chimériques contenant la partie carboxy-terminale du NTSR3 (Nielsen et al., 2001). Ce même récepteur exprimé de manière endogène par les cellules d'un organisme présente-t-il les mêmes fonctions cellulaires ? C'est une question qui reste, aujourd'hui, en suspens.

6-2 Rôle du NTSR3 dans l'adressage de ses ligands au milieu extracellulaire :

Figure 28

La localisation du NTSR3 au niveau de l'appareil de Golgi et du TGN laisse penser que ce récepteur pourrait interagir au niveau de ces compartiments subcellulaires avec ses propres ligands et notamment avec la neurotensine en cours de maturation pour les acheminer, en les protégeant de la dégradation, au niveau de la surface cellulaire pour les y libérer. En effet, comme nous l'avons observé dans le premier chapitre de ce manuscrit, la neurotensine est maturée conjointement à la neuromédine N à partir d'un précurseur polypeptidique commun, la pro-NT/NN (Dobner et al., 1987). Le profil de maturation de ce précurseur varie suivant le type de tissu ou le type cellulaire conduisant ainsi à des formes peptidiques plus ou moins longues se terminant soit par la NT (large-NT), soit par la Neuromédine N (large-NN). Cette maturation s'effectue par l'intermédiaire de pro-hormones convertases (PC), généralement au niveau du réseau trans-golgien. Rovère et al. ont par ailleurs montré que les formes large-NT et large-NN étaient exprimées par un grand nombre de cellules cancéreuses humaines de côlon (Rovère et al., 1998). Dal Farra et al. ont également montré que le NTSR3 était présent dans toutes les lignées cancéreuses caractérisées par Rovère et al. (Dal Farra et al., 2001). Le fait que le NTSR3 soit capable de lier la NT mais aussi les formes non maturées de la neurotensine (large-NT et large-NN) in vitro (Carole Rovère, Morten Nielsen, communications personnelles) permet d'envisager un rôle du NTSR3 en tant que transporteur de la NT et/ou de ses larges formes du TGN au milieu extracellulaire. Ces larges formes peuvent par ailleurs se lier et activer le NTSR1 humain (Friry et al., 2002). Bien que cette activation soit moins importante que celle induite par la NT elle-même, les larges formes sont nettement plus résistantes à la dégradation que la neurotensine ou la neuromédine N (Friry et al., 2002). On peut alors aisément envisager un mécanisme d'activation cellulaire par lequel, dans un premier temps, le NTSR3 adresserait ou transporterait les larges formes (large-NT et/ou large-NN), la NT ou bien un autre de ses ligands, du TGN au milieu extracellulaire (Figure 28). Puis, dans un second temps, les ligands ainsi libérés dans le milieu extracellulaire pourraient activer une population de récepteurs de surface (NTS1, NTSR2, NTSR3 ou un autre récepteur) soit sur cette même cellule (action autocrine) soit à distance, sur une population cellulaire voisine ou non (action paracrine) (Figure 28).

Comme nous l'avons détaillé auparavant, le NTSR3 est synthétisé sous la forme d'un précurseur qui est maturé au niveau du réseau trans-golgien par la furine (Munck Petersen et al., 1999). Cette maturation génère deux entités à savoir le récepteur actif d'une part et un peptide de 44 résidus appelé propeptide d'autre part. Au laboratoire, nous avons montré que ce propeptide pouvait se lier et déplacer la liaison de la neurotensine aux deux récepteurs de la NT couplés aux protéines-G, le NTSR1 et le NTSR2, avec des valeurs d'IC50 de 63 nM et 87 nM respectivement (résultats personnels non publiés). Le propeptide, libéré après maturation du NTSR3 par la furine, pourrait être pris en charge par le NTSR3 mature et être libéré dans le milieu extracellulaire (Figure 28). A ce niveau, le propeptide pourrait, de la même manière que la NT ou que les formes large-NT et large-NN, se lier à un des trois récepteurs de la NT et ainsi induire un signal au niveau intracellulaire (Figure 28).

La Lipoprotéine Lipase (LpL) est également un ligand pour le NTSR3. Ces deux protéines sont conjointement exprimées au cours de la différenciation des cellules adipocytaires 3T3-L1 (Morris et al., 1998 ; Nielsen et al., 1999). Un mécanisme identique de transport de la LpL par le NTSR3 du TGN aux voies de sécrétion est, dans ce cas présent, parfaitement envisageable (Figure 28).


6-3 Rôle du NTSR3 en tant que récepteur " scavenger " :
Nous avons vu que le complexe NT-NTSR3 était efficacement internalisé et que, malgré cette endocytose, la quantité de récepteur présente à la surface cellulaire restait constante (Article 3, Navarro et al., 2001). Nielsen et al. ont également montré que le NTSR3 pouvait internaliser la LpL à la fois dans des cellules transfectées avec l'ADNc codant pour le NTSR3 humain ou dans les cellules 3T3-L1 différenciées qui expriment naturellement le récepteur murin (Nielsen et al., 1999). La LpL, une fois internalisée par le NTSR3, est rapidement dégradée par un mécanisme sensible aux agents alcalins comme la chloroquine. Ceci suggère que la dégradation de la LpL s'effectue dans un compartiment acide de type lysosomial (Nielsen et al., 1999). Ces travaux amènent à la conclusion que le NTSR3 pourrait posséder une autre fonction au sein de la cellule en débarrassant le milieu extracellulaire des ligands neurotensine ou lipoprotéine lipase, en les internalisant au niveau de la surface cellulaire puis en les adressant aux lysosomes pour qu'ils y soient dégradés.

Ce processus de type récepteur " scavenger " a été montré pour plusieurs récepteurs et intervient essentiellement au niveau du système immunitaire ou du métabolisme lipidique en recrutant et en internalisant les LDL (Low-Density Lipoproteins) (pour revue, Peiser et al., 2002). Récemment, le récepteur de l'hémoglobine (Hb) CD163 ou HbSR (pour Haemoglobin Scavenger Receptor) a été isolé et identifié comme étant impliqué dans le " nettoyage " de l'hémoglobine présente dans la circulation sanguine (Kristiansen et al., 2001). Ce récepteur de 130 kDa présente un seul domaine transmembranaire et appartient à la famille des récepteurs SRCR (Scavenger Receptor Cystein Rich domain) (pour revue, Resnick et al., 1994). Il est très fortement exprimé à la surface des macrophages. Sa fonction première est de lier et d'internaliser les complexes circulants d'hémoglobine-haptoglobine. L'haptoglobine (Hp) est une protéine circulante qui se lie avec une très forte affinité à l'hémoglobine libérée lors de l'hémolyse des érythrocytes. Ce complexe Hb-Hp forme un nouveau motif qui constitue un site de reconnaissance pour le récepteur HbSR exprimé à la surface des macrophages. Les complexes (Hb-Hp)-récepteur sont internalisés par les macrophages, et l'hémoglobine peut alors être dégradée (Kristiansen et al., 2001).

Il est aujourd'hui admis que le NTSR3 est une protéine multi-fonctionnelle. En effet, le fait que son extrémité carboxy-terminale renferme des motifs impliqués dans l'adressage des protéines du TGN aux endosomes de même que son importance fonctionnelle dans l'internalisation et la dégradation de la lipoprotéine lipase ne laisse aucun doute quant à la multifonctionnalité de cette protéine. Une question importante concernant le NTSR3 reste cependant en suspens. Le NTSR3 présent au niveau de la surface cellulaire permet-il la transmission d'un signal au niveau intracellulaire ? Une grande partie de mon travail de thèse a consisté à tenter de répondre à cette question essentielle et à mettre en évidence une ou plusieurs voies de signalisation induite par la neurotensine et transduite par ce nouveau type de récepteur de neuropeptide.


6-4 Le complexe NT-NTSR3 génère-t-il un signal intracellulaire ?
De manière générale, les voies de transduction passant par les récepteurs de la neurotensine ont été étudiées sur des cellules transfectées avec les ADNc codant pour les différents sous-type de récepteurs de la neurotensine ou bien sur des cellules cancéreuses exprimant un ou plusieurs de ces sous-types. Pour le NTSR3, les seuls éléments connus à ce jour concernant ses voies de signalisation reposent sur un travail récent, réalisé au laboratoire par Dal Farra et al., qui a montré que l'application de neurotensine exogène sur des cellules CHO transfectées avec l'ADNc codant pour le hNTSR3 induisait une augmentation de la synthèse d'ADN (Dal Farra et al., 2001). Ces résultats semblent indiquer que le NTSR3 participerait aux effets de type facteur de croissance décrits pour la neurotensine.

6-4-1 Le NTSR3 dans les cellules microgliales humaines C13NJ :
Afin de mettre en évidence de nouvelles voies de signalisation associées au récepteur de type 3 humain, nous nous sommes intéressés à une lignée cellulaire microgliale humaine, les cellules C13NJ. Cette lignée cellulaire nous a été gracieusement fournie par le Dr. Marc Tardieu (Université Paris-sud, le Kremlin-Bicêtre). Ces cellules microgliales ont été immortalisées à partir de macrophages cérébraux embryonnaires humains par transfection stable d'un ADNc codant pour l'antigène T du virus SV40 et présentent des caractéristiques identiques à celles observées pour des cellules embryonnaires microgliales en culture primaire (Janabi et al., 1995).

Les travaux que nous avons réalisés sur cette lignée cellulaire nous ont permis d'obtenir des informations intéressantes sur les voies de signalisation induites par la neurotensine passant par le NTSR3 (Article 5, soumis à publication).

Article 5 : Stéphane Martin, Jean-Pierre Vincent and Jean Mazella. Requirement of functional Neurotensin receptor-3 for human microglial cell migration. Soumis à publication.

Figure 29

Par marquage covalent, en incubant les cellules C13NJ avec un dérivé photoactivable et iodé de la NT, nous avons pu mettre en évidence une protéine, spécifiquement radiomarquée, d'un poids moléculaire de 110 kDa. Par immunomarquage, en utilisant des anticorps dirigés contre le hNTSR3, nous avons pu révéler que cette protéine de 110 kDa correspondait au NTSR3 (Figure 29-A). Pour confirmer la présence de ce récepteur dans ces cellules, nous avons étudié leur contenu intracellulaire en ARNm par RT-PCR en utilisant des oligonucléotides sens et antisens spécifiques des récepteurs humains de la NT connus à ce jour (Figure 29-B). Les transcrits codant pour le hNTS1 et le hNTS2 ne sont pas détectables dans les cellules C13NJ. En revanche, un produit de PCR spécifique correspondant aux ARNm du hNTSR3 a pu être observé (Figure 29-B). Le NTSR3 présente une distribution subcellulaire comparable à ce qui est décrit dans la littérature à savoir au niveau des compartiments Golgi-TGN (Figure 29-C).

Nous avons mesuré les paramètres de liaison de la NT sur cellules entières par des expériences de saturation en utilisant des concentrations croissantes de neurotensine iodée. La liaison est saturable, réversible et nous avons obtenu des valeurs de Kd de l'ordre de 2 à 4 nM avec une capacité fixatrice maximale de 30 fmol/mg de protéines. La liaison de la NT sur ce type cellulaire est, comme l'on pouvait s'y attendre, totalement insensible à la lévocabastine, un composé capable de déplacer la liaison de la NT au NTSR2. Par dosages radioimmunologiques réalisés à la fois sur des surnageants de culture ou sur des extraits cellulaires solubilisés, nous n'avons à aucun moment pu détecter de précurseur de la NT, ni la NT elle-même. Ces cellules microgliales en culture ne semblent donc pas capable de synthétiser la neurotensine.

Figure 30

Nous venons de voir que le NTSR3 exprimé de manière endogène dans les cellules C13NJ liait spécifiquement la neurotensine. Nous avons cherché à mettre en évidence des voies de signalisation de la NT passant par le NTSR3 dans cette lignée cellulaire. Ainsi, nous avons pu montrer que la NT activait respectivement, par l'intermédiaire du NTSR3, les voies MAP kinases et Akt ().

- La liaison de la NT au NTSR3 active les voies Erk et Akt dans les cellules C13NJ :
La phosphorylation des kinases Erk 1 et 2, reflétant leur état d'activation, est transitoire et maximale pour des temps d'incubation courts en présence de peptide (2,5 min) et pour des doses de peptide de l'ordre de 10 nM (Figure 30). La spécificité de cette activation par la NT a été confirmée en préincubant les cellules C13NJ avec un inhibiteur spécifique de la voie Erk, le PD98059 (Figure 30).

De la même manière, la NT induit la phosphorylation de Akt (également appelé protéine kinase B ou PKB) qui se produit moins rapidement qu'avec les MAP kinases (activation maximale en 30 minutes) mais qui est maintenue au cours du temps (Figure 30). La stimulation est maximale pour des valeurs de concentrations en NT de 1 à 10 nM. La phosphorylation de Akt fait intervenir la voie des PI3 kinases puisqu'elle est spécifiquement bloquée par deux inhibiteurs de cette voie, la wortmaninne et le LY294002 (Figure 30). Il faut toutefois noter que ces deux voies de signalisation ne sont pas activées par la neurotensine dans des cellules exprimant le hNTSR3 cloné (résultats personnels non publiés).

Nous venons de montrer que la neurotensine pouvait induire une réponse intracellulaire par l'intermédiaire du hNTSR3 dans les cellules microgliales humaines C13NJ. Afin de mettre en évidence un rôle fonctionnel de ce récepteur dans ces cellules, nous nous avons testé l'effet de la NT sur la croissance de ces cellules, soit par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée, soit par mesure de l'activité mitochondriale. A aucun moment et quelque soit la dose de neurotensine utilisée, nous n'avons détecté d'effet de ce peptide sur la prolifération de ces cellules en culture. Ces résultats sont différents de ceux obtenus par Dal Farra et al. qui montraient que la NT stimulait l'incorporation de thymidine tritiée dans des cellules CHO exprimant de manière stable le hNTSR3 (Dal Farra et al., 2001). Ces travaux indiquent que les évènements intracellulaires faisant suite à la liaison de la NT au NTSR3 sont différents suivant les types cellulaires dans lesquels le NTSR3 est exprimé. Ceci suggèrent que les cellules CHO dans lesquelles l'ADNc codant pour le NTSR3 humain a été transfecté et les cellules microgliales, qui expriment naturellement ce récepteur, ne présentent pas les mêmes équipements enzymatiques.

Les cellules microgliales font partie intégrante du système immunitaire et de ce fait possèdent des fonctions importantes dans les mécanismes de défense de l'organisme face aux événements pathologiques (inflammation, lésion, etc…). En réponse à des agressions au niveau cérébral, les cellules de la microglie modifient leur phénotype cellulaire et peuvent alors migrer en direction du site de la lésion et sont de ce fait le constituant cellulaire majeur de la cicatrisation gliale (pour revues, Ridet et al., 1997 ; Aloisi, 2001). La migration cellulaire faisant suite à une agression nécessite l'intervention de multiples partenaires et requiert, en particulier, la participation des récepteurs de l'adhésion cellulaire, du cytosquelette d'actine ou encore des GTPases de la famille Rho (pour revues, Lauffenburger et Horwitz, 1996 ; Hall, 1998).

- La liaison de la NT au NTSR3 induit la migration des cellules C13NJ :
Dans notre étude concernant les cellules microgliales C13NJ, nous nous sommes intéressés aux effets de la neurotensine à la fois sur la migration de ces cellules en réponse à une agression et sur le rôle de la NT en tant que facteur d'attraction cellulaire. De nombreuses études ont révélé que la NT pouvait jouer un rôle important lors des processus d'inflammation. C'est le cas pour les neutrophiles, par exemple, sur lesquels la NT induit une augmentation de leur capacité de migration et de phagocytose (Goldman et al., 1983). De même, la neurotensine stimule différentes étapes du processus de phagocytose par les macrophages et notamment leur chimioattraction (De la Fuente et al., 1993). Ces mêmes résultats ont, par ailleurs, été observés sur des lymphocytes murins en culture primaire (Garrido et al., 1992).

Figure 32

Figure 31

Dans notre système cellulaire, nous avons montré que la NT stimulait la migration des cellules microgliales en culture en réponse à une lésion mécanique simulant une cicatrice tissulaire (stries) pour des doses de peptide allant de 1 à 100 nM (Figure 31). La NT agit également, dans ces mêmes gammes de concentration, en tant que molécule attractive des cellules microgliales C13NJ. L'effet chimioattractant du peptide est partiellement bloqué par l'inhibiteur de la voie MAP kinase, le PD98059, mais est totalement prévenu par les deux inhibiteurs de la voie des PI3 kinases (Figure 32). Ces résultats suggèrent que l'activation par la liaison de la NT au NTSR3 de la voie PI3 kinases par la neurotensine est essentielle pour la chimioattraction et la migration des cellules microgliales C13NJ. Au niveau cérébral, une lésion ou une inflammation pourrait être accompagnée d'un relargage de NT par les cellules voisines du lieu de l'agression tissulaire créant ainsi un gradient de concentration en peptide aboutissant à l'attraction et à la migration des cellules microgliales au site de la lésion.

Il semble, à la vue de ces résultats, que la neurotensine, par l'intermédiaire du NTSR3, joue un rôle important dans les processus de migration et de chimioattraction des cellules microgliales humaines en culture par un mécanisme dépendant de la voie médiée par les PI3 kinases. Ces résultats sont en accord avec les travaux réalisés par Ramez et al. qui montrent que la neurotensine n'induit pas la prolifération des lymphocytes T mais provoque leur migration en augmentant leur capacité de chimioattraction (Ramez et al., 2001).

Figure 33

- La liaison de la NT au NTSR3 induit des modifications au niveau du cytosquelette d'actine : Nous avons vu précédemment que la migration cellulaire s'accompagnait inévitablement de modifications au niveau du cytosquelette d'actine. Afin de confirmer le pouvoir attractant de la NT conduisant à la migration des cellules microgliales, nous nous sommes intéressés aux modifications morphologiques et principalement à la redistribution subcellulaire des filaments d'actine faisant suite à une application exogène de neurotensine (Figure 33). La NT entraîne la formation rapide de filopodes caractéristiques de la migration cellulaire. Ces modifications du cytosquelette d'actine sont totalement bloquées par l'inhibiteur de la voie PI3 kinases (Figure 33) et partiellement prévenues par l'inhibiteur de la voie MAP kinases.

Au cours de ces travaux, nous avons montré que la liaison de la neurotensine au NTSR3 induisait l'activation de la voie des MAP kinases Erk et de la voie Akt via les PI3 kinases. Ces activations et notamment celle passant par les PI3 kinases entraîne la réorganisation subcellulaire des filaments d'actine et constitue, de ce fait, une étape importante du processus de migration des cellules microgliales humaines C13NJ.


6-4-2 Le NTSR3 dans les cellules HT29 module la signalisation NT-NTSR1 :
L'étude de la signalisation des récepteurs de la neurotensine a majoritairement été réalisée sur des cellules d'origine cancéreuse. L'application exogène du peptide sur ces cellules conduit, dans la plupart des cas, à la prolifération de ces cellules aussi bien en culture qu'après injection de peptide dans des souris nude préalablement inoculées avec des cellules cancéreuses. Ainsi, la neurotensine agit comme un facteur trophique sur des cellules cancéreuses issues de tissus divers tels que les cellules de cancer pancréatique MIA PaCa-2 (Yamada et al., 1995 ; Iwase et al., 1997) ou PANC-1 (Guha et al., 2002), de cancer de la prostate LNCaP (Sehgal et al., 1994), de cancer de poumon à petites cellules SCLC (Davis et al., 1991 ; Moody et al., 2001) ou encore sur des cellules de cancer de côlon comme les cellules HT29 (Maoret et al., 1999). De la même manière, la neurotensine stimule la croissance des cellules cancéreuses de côlon humain SW480 et HCT116 injectées dans des souris nude et entraîne une augmentation concomitante de leur synthèse d'ADN et du volume des tumeurs qu'elles induisent (Maoret et al., 1999). Cependant, il faut noter que ces cellules expriment à la fois le NTSR1 et le NTSR3 et il est donc difficile de déterminer quel sous-type de récepteur est responsable de ces effets (Dal Farra et al., 2001). Un autre exemple très intéressant vient des cellules LoVo qui sont issues d'un cancer de côlon. Ces cellules n'expriment que le NTSR3 et la NT n'est pas capable d'induire leur prolifération en culture ce qui est en accord avec les travaux que nous avons réalisés sur les cellules microgliales C13NJ (Article 5). Cependant, les cellules LoVo ont la capacité, une fois injectées dans des souris nude, de former des tumeurs, qui répondent aux injections de neurotensine, par une augmentation rapide de leur volume (Yoshinaga et al., 1992 ; Iwase et al., 1996).

Ces différents travaux montrent sans nul doute un rôle de la neurotensine en tant que facteur de croissance sur ces différentes lignées cellulaires que ce soit en culture ou après injection dans des souris immunodéprimées. Cependant, le fait que des cellules n'exprimant pas le NTSR1 répondent également à la NT indique que le rôle de facteur trophique de la neurotensine est un processus complexe.

Les cellules HT29 sont issues d'un adénocarcinome de côlon humain. Ces cellules expriment à la fois le hNTS1 (Vita et al., 1993) et le NTSR3 (Articles 4 et 6). L'application exogène de neurotensine sur ces cellules entraîne une augmentation de la synthèse des phospho-inositides, une activation de la voie des MAP kinases ou encore l'activation de la synthèse de gènes précoces impliqués dans la prolifération cellulaire (Krox-24). Ces effets étaient attribués jusqu'à présent au seul NTSR1. Nous avons montré, dans l'article 4, que le NTSR3 liait la NT au niveau de la surface des cellules HT29. Le complexe NT-NTSR3 est alors internalisé et le peptide se retrouve rapidement au niveau du noyau par un mécanisme qui reste à mettre en évidence mais qui implique sans doute la participation du NTSR3 (Article 4). Le fait que les cellules HT29 expriment à la fois le NTSR1 et le NTSR3 de manière endogène a constitué pour nous un système de choix pour étudier de possibles interactions entre ces deux récepteurs. Les résultats de ces travaux sont regroupés dans les paragraphes suivants (Article 6).

Article 6 : Stéphane Martin, Valérie Navarro, Jean-Pierre Vincent and Jean Mazella. Neurotensin receptor-1 and -3 complex modulates the cellular signaling of neurotensin in the HT29 cell line. (2002) Gastroenterology (sous presse).

Cette étude a été réalisable grâce à l'utilisation de l'anticorps dirigé contre le NTSR3 (gracieusement fourni par le Dr Petersen, Aarhus, Danemark). Ainsi, il nous a été possible de mettre en évidence, par immunoprécipitation, le processus de dimérisation entre un récepteur couplé aux protéines-G, le NTSR1, et le NTSR3, un récepteur à un seul domaine transmembranaire. Ce résultat a été obtenu aussi bien dans les cellules HT29 que dans les cellules CHO transfectées avec les ADNc codant pour ces deux récepteurs.

Figure 35

Figure 34

Le NTSR1 est coimmunoprécipité avec le NTSR3 dans les cellules HT29 non stimulées suggérant ainsi que la dimérisation n'est pas provoquée par le ligand (Figure 34-B, piste 1). En présence de neurotensine, l'hétérodimère NTSR1-NTSR3 est internalisé (Figure 34-A). Ce résultat est confirmé sur la figure 34-B (pistes 2-4) où l'on peut remarquer que la quantité de NTSR1 de surface coimmunoprécipité par le NTSR3 diminue en présence de peptide sans que la quantité de NTSR1 total coimmunoprécipité ne varie. Par microscopie confocale, nous avons confirmé la présence et la colocalisation des deux récepteurs à la surface des cellules HT29 (Figure 35).

Figure 36

Nous avons également montré ce processus de dimérisation entre le NTSR1 et le NTSR3 dans les cellules CHO tranfectées avec les ADNc codant pour ces deux récepteurs (Figure 36).

Figure 37

Afin de mettre en évidence le rôle de cette dimérisation sur la signalisation intracellulaire induite par la neurotensine, nous avons mesuré et comparé l'effet du peptide à la fois sur l'activation de la voie des MAP kinases et sur l'accumulation de phospho-inositides dans les cellules HT29, dans les cellules CHO exprimant séparément le NTSR1 et le NTSR3 ou dans les cellules CHO exprimant les deux récepteurs (Figure 37). Ainsi, la présence simultanée des deux types de récepteurs dont une partie est présente sous forme d'hétérodimère, dans les cellules CHO cotransfectées ou dans les cellules HT29, a pour effet de diminuer la puissance de la neurotensine à activer ces deux voies de transduction par rapport aux cellules CHO qui n'expriment que le NTSR1. Dans les cellules CHO exprimant le NTSR3 seul, aucune des deux voies de transduction n'est activée (Figure 37). Cependant, nous avons vu précédemment que le hNTSR3, dans les cellules microgliales en présence de NT activait la voie des MAP kinases (Article 5). La comparaison des profils d'activation des protéines de la voie MAP kinases obtenus en présence de NT entre les cellules HT29 et les cellules CHO exprimant le NTSR1 seul laisse penser que le NTSR3, dans ce type cellulaire, ne participe pas à l'activation de ces kinases mais plutôt à la modulation de cette activation générée par la liaison de la NT au NTSR1.

Dans ce travail, nous avons pu mettre en évidence la dimérisation existant entre le NTSR1 et le NTSR3 à la fois dans les cellules cancéreuses HT29 qui expriment ces deux récepteurs de manière endogène et dans les cellules CHO cotransfectées avec les ADNc codant pour ces deux mêmes récepteurs. Nous avons également montré que ces récepteurs structurellement différents étaient en interaction à la surface cellulaire en absence de stimulation et que la stimulation par la NT induisait l'internalisation d'une partie de ce complexe. Ce processus d'hétérodimérisation modifie de manière significative les réponses cellulaires induites par la liaison de la NT au NTSR1 en modulant à la fois le profil d'activation des MAP kinases et la formation des inositols phosphates.

Un processus de multimérisation entre un récepteur couplé aux protéines-G et un récepteur à un seul domaine transmembranaire a déjà été rapporté dans la littérature entre le récepteur b2-adrénergique (b2AR) et un récepteur à activité tyrosine kinase, le récepteur de l'EGF (Epidermal Growth Factor). Maudsley et al. ont montré que l'isoprotérénol, un agoniste du récepteur b2AR, transactivait le récepteur de l'EGF (EGFR) en induisant son homodimérisation et son autophosphorylation sur des résidus de tyrosine au niveau de son extrémité intracytoplasmique. Cette transactivation est suivie de la formation d'un complexe comprenant l'homodimère de récepteurs EGF et le b2AR activé au niveau de la surface cellulaire (Maudsley et al., 2000). Les récepteurs b2AR et EGFR de ce complexe sont alors internalisés par un mécanisme faisant intervenir les puits tapissés de clathrine. Cette étape d'internalisation induit l'activation de la voie des MAP kinases (Maudsley et al., 2000). De nombreux autres récepteurs couplés aux protéines-G peuvent transactiver le récepteur de l'EGF mais jusqu'à aujourd'hui aucun processus de dimérisation entre l'EGFR et ces autres RCPG n'a pu être démontré (pour revue, Gschwind et al., 2001).

Figure 38

D'autres travaux ont rapporté des processus d'hétérodimérisation entre des RCPG et des protéines à un seul domaine transmembranaire. Ces protéines ne sont pas considérées comme des récepteurs puisque leurs ligands, si elles en possèdent, n'ont pas encore été identifiés. Un tel processus d'hétérodimérisation a été observé pour les protéines de la famille RAMP (receptor-activity modifying protein) (pour revue, Bouvier, 2001 ; Sexton et al., 2001). Ainsi, comme il est représenté sur la figure 38, l'association du récepteur CRLR (calcitonin receptor-like receptor) avec RAMP-1 est une étape nécessaire à sa glycosylation terminale et à son transport à la surface cellulaire où il pourra lier le CGRP (calcitonin gene-related peptide) (McLatchie et al., 1998 ; Fraser et al., 1999). Hilairet et al. ont également montré que les hétérodimères CRLR-RAMP-1 activés par le CGRP étaient internalisés via des puits tapissés de clathrine dans un complexe faisant intervenir les b-arrestines, et qu'ils étaient ensuite adressés dans les compartiments lysosomiaux pour y être dégradés (Kuwasako et al., 2000 ; Hilairet et al., 2001). Il faut cependant noter que ces deux protéines, lorsqu'elles sont exprimées indépendamment, ne peuvent générer de réponse au niveau intracellulaire (McLatchie et al., 1998). De la même manière, le complexe formé entre les protéines RAMP-2 ou -3 et le récepteur CRLR permet l'adressage du récepteur à la surface cellulaire mais le ligand reconnu par cet hétérodimère n'est plus le CGRP mais l'adrénomédulline (McLatchie et al., 1998 ; Christopoulos et al., 1999) (Figure 38). L'hétérodimérisation du récepteur de la calcitonine (CTR) avec RAMP-1 ou RAMP-3 mais pas avec RAMP-2 se traduit par l'apparition à la surface cellulaire d'un récepteur fonctionnel qui est capable de lier l'amyline et peut ainsi induire la production d'AMPc (Christopoulos et al., 1999).

Plus récemment, une protéine de 28 kDa appelée calcyon présentant un seul domaine transmembranaire, a été isolée en utilisant la technique du double hybride avec comme " appât ", les résidus carboxy-terminaux du récepteur de la dopamine D1 (D1R) (Lezcano et al., 2000). Cette protéine comporte deux sites potentiels de N-glycosylation au niveau de son extrémité amino-terminale et un site carboxy-terminal (intracellulaire) de phosphorylation par la protéine kinase C (PKC). Elle présente de plus de fortes homologies de séquence avec deux protéines (P19 et P21) de fonction inconnue. Lezcano et al. ont montré que la protéine calcyon était majoritairement exprimée au niveau des corps cellulaires et des prolongements neuronaux du cortex préfrontal et de l'hippocampe et présentait un parfait recouvrement avec la distribution subcellulaire des récepteurs D1R (Lezcano et al., 2000). Le récepteur D1R et la protéine calcyon interagissent pour former un hétérodimère. Ce complexe calcyon-D1R potentialise la mobilisation du calcium intracellulaire induite par un agoniste du récepteur D1R grâce à un mécanisme faisant intervenir les PKC (Lezcano et al., 2000). Lidow et al. ont par ailleurs montré que la co-expression de la protéine calcyon dans des cellules exprimant le récepteur D1R ne modifiait pas les paramètres de liaison des agonistes ou des antagonistes dopaminergiques pour le récepteur D1R (Lidow et al., 2001).

Bien que ces protéines à un seul domaine transmembranaire permettent la génération ou la modulation d'un signal passant par un récepteur couplé aux protéines-G, il n'en demeure pas moins que ce ne sont pas eux-mêmes des récepteurs, contrairement au NTSR3 pour lequel nous avons vu que la neurotensine pouvait, par son intermédiaire, activer des voies de signalisation propres.