Quatrième partie - Conclusions et perspectives :


Au cours de cette revue, nous avons vu que la neurotensine présentait un spectre d'activités biologiques et pharmacologiques très varié (Première partie). Ces différents effets sont médiés par des récepteurs spécifiques qui, à ce jour, sont au nombre de trois. Les deux premiers récepteurs de la NT a avoir été isolés, le NTSR1 et le NTSR2, appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines-G. Malgré une forte homologie de structure entre ces deux récepteurs, leurs comportements vis-à-vis de la NT, au niveau de leur couplage ou de leur trafic intracellulaire respectifs présentent de nombreuses variations (Deuxième partie). Le troisième type de récepteur de la neurotensine est, quant à lui, totalement différent des deux précédents. En effet, il ne possède qu'un seul domaine transmembranaire et constitue de ce fait un nouveau type de récepteur pour les neuropeptides (Troisième partie).


Perspectives concernant le NTSR1 :
Le NTSR1 est un récepteur relativement classique. Nous avons vu qu'il activait, après liaison de la NT, plusieurs effecteurs via les protéines-G et qu'il était internalisé par un mécanisme classique faisant intervenir les puits tapissés de clathrine. Cependant, il ne faut pas oublier que tous les résultats publiés sur ce récepteur ont été obtenus soit sur le récepteur cloné, exprimé de manière artificielle, soit dans des cellules cancéreuses qui expriment également le NTSR3. Par conséquent, il serait appréciable de pouvoir étudier ce récepteur dans des cellules qui l'expriment de manière endogène et sans autre partenaire protéique susceptible d'en moduler le fonctionnement, afin de comparer son comportement vis-à-vis de la NT par rapport aux données de la littérature.


Perspectives concernant le NTSR2 :
Les données bibliographiques concernant le NTSR2 sont, quant à elles, plus controversées. En effet, nous avons vu au travers de ce manuscrit que la NT pourrait ne pas être l'agoniste de ce récepteur. Cependant, nous ne disposons pas de cellules ou de lignée cellulaire dans lesquelles ce récepteur est exprimé seul et de manière endogène. L'existence de ces cellules permettrait sans nul doute de statuer sur l'état agoniste, agoniste inverse ou antagoniste neutre de la NT vis-à-vis du NTSR2. Malgré tout, les travaux récents publiés par Richard et al. indiquent que le NTSR2 présente une activité basale, c'est-à-dire en absence de ligand, qui est proportionnelle à la quantité de récepteur exprimée par la cellule (Richard et al., 2001). Cette activité basale a-t-elle une fonction au sein de la cellule ? C'est une question à laquelle il nous faudra répondre dans les années qui viennent et qui pourra certainement aider à la compréhension du système neurotensinergique.

Nous avons montré que le recyclage des récepteurs de la NT couplés aux protéines-G dépendait de la présence d'un résidu de tyrosine au niveau de leur troisième boucle intracellulaire. Ce résidu est phosphorylé en réponse à une application de NT exogène et cet état phosphorylé est indispensable au recyclage du récepteur à la surface cellulaire après internalisation. Afin de poursuivre ce travail, il serait judicieux d'étudier les protéines impliquées dans ce processus de recyclage et en particulier de mettre en évidence la (ou les) tyrosine(s) kinase(s) responsable(s) de la phosphorylation de ce récepteur. Par ailleurs, la détermination des motifs responsables de l'internalisation du NTSR2 (motifs présents au niveau de la troisième boucle intracellulaire) ainsi que du trafic intracellulaire du récepteur en réponse à la NT apporterait des éléments nouveaux dans la compréhension du mode de fonctionnement du NTSR2.

La mise en évidence récente par Sun et al. de l'organisation génomique du NTSR2 pourrait permettre l'invalidation chez la souris du gène codant pour le NTSR2 (Sun et al., 2001). Si cette invalidation du NTSR2 n'est pas létale, elle permettrait de mieux comprendre les voies et les mécanismes par lesquels la neurotensine agit pour entraîner une analgésie indépendante de la voie des opiacées. A plus long terme, on peut également envisager de produire des souris transgéniques pour le NTSR2 muté sur la tyrosine 237 ou sur l'alanine 79 et ainsi étudier l'importance du recyclage ou de la sensibilité aux ions sodium de ces récepteurs au niveau physiologique chez la souris.


Perspectives concernant le NTSR3 :
Dans ce mémoire, nous avons vu que la famille des récepteurs de la neurotensine s'était enrichie d'un nouveau membre, le NTSR3. Ce récepteur présente une structure totalement différente de celles des deux récepteurs isolés auparavant et semble pouvoir remplir des fonctions distinctes au sein de la cellule. Ainsi, il peut lier différents ligands et présente des fonctions, aussi bien au niveau intracellulaire, de type récepteur de " sorting ", qu'au niveau de la membrane plasmique où il agit comme un récepteur de la neurotensine en transmettant un signal à l'intérieur du cytoplasme de la cellule. Les perspectives concernant le rôle du NTSR3 sont multiples du fait de sa découverte récente et de l'existence de ses nombreux ligands dont la liste ne fait que s'agrandir (deux autres nouveaux ligands du NTSR3 sont en cours de caractérisation dans le laboratoire du Dr. C. Petersen ; Dr. M. Nielsen, communications personnelles).


Dans les cellules microgliales humaines C13NJ :
La liaison de la NT au NTSR3 présent à la surface des cellules microgliales induit l'activation des voies MAP kinases et PI3 kinases ce qui conduit à la migration de ces cellules en culture. La migration des cellules par la neurotensine nécessite la redistribution des filaments d'actine de leur cytosquelette. De nombreuses études ont rapporté l'importance des ions calcium dans le processus de migration cellulaire. Matyash et al. ont par ailleurs récemment démontré que le récepteur de la ryanodine de type 3 (RyR3), qui est impliqué dans le contrôle des réserves calciques de la cellule, était exprimé dans les astrocytes en culture primaire. L'inhibition de l'activité de ces récepteurs, soit chimiquement à l'aide d'antagonistes de ce récepteur, soit après invalidation du gène codant pour les récepteurs RyR3, prévient totalement la migration astrocytaire (Matyash et al., 2002). Ces résultats révèlent que les flux calciques jouent un rôle prépondérant dans le contrôle de la mobilité astrocytaire. Dans notre système cellulaire, il serait par conséquent intéressant d'étudier les effets d'une application exogène de neurotensine sur la mobilisation du calcium intracellulaire qui joue un rôle prépondérant notamment dans la formation des filopodes caractéristiques de la mobilité cellulaire. Cette approche nécessite également l'étude de la phosphorylation des GTPases de la famille Rho qui sont également impliquées dans les processus de mobilité cellulaire en modulant la formation des filaments d'actine (pour revue, Hall, 1998).

La migration cellulaire fait, par ailleurs, intervenir des protéines du cytosquelette comme les intégrines ou la protéine FAK (Focal Adhesion Kinase), une protéine à activité tyrosine-kinase associée aux intégrines au niveau des points d'ancrage des cellules adhérentes. La protéine FAK est phosphorylée sur des résidus de tyrosine et cet état phosphorylé est essentiel au processus de la mobilité cellulaire (Owen et al., 1999). De plus, très récemment, Leyton et al. ont démontré que la NT induisait la phosphorylation de FAK dans les cellules NCI-H1299 issues d'une lignée cellulaire cancéreuse de poumon (Leyton et al., 2002).

Au laboratoire, nous avons débuté l'étude du profil d'activation de FAK en réponse à la NT dans les cellules microgliales C13NJ (Figure 39). Pour ce faire, les cellules microgliales sont incubées en présence de NT, lysées en présence d'inhibiteurs de phosphatases et les protéines phosphorylées sont immunoprécipitées avec des anticorps spécifiques des résidus de tyrosine phosphorylée. Après séparation des protéines sur gel dénaturant, FAK activé (phosphorylé) est révélé par western blot en utilisant un anticorps dirigé contre FAK (Figure 39). Ces résultats, bien que préliminaires, montrent que la neurotensine peut induire la phosphorylation de FAK. Ces résultats nécessitent d'être approfondis pour confirmer l'implication du NTSR3 dans la migration microgliale induite par la neurotensine.


Dans les cellules cancéreuses humaines HT29 :
Au cours de mes travaux de thèse, j'ai été amené à étudier à la fois le trafic intracellulaire du complexe NT-NTSR3 et les possibles interactions entre le NTSR1 et le NTSR3 qui sont tous deux exprimés de manière endogène dans les cellules humaines de cancer de côlon HT29. Les résultats que nous avons obtenus sont certes très intéressants mais nécessitent d'être approfondis.

- Au niveau du trafic intracellulaire du NTSR3 : Le NTSR3 internalise par la voie endosomale classique faisant intervenir les puits tapissés de clathrine. Le trafic intracellulaire qui suit à cette endocytose est cependant plus complexe. En effet, la quantité de NTSR3 de surface ne varie pas au cours du temps d'exposition avec le peptide ce qui suggère un mécanisme de recyclage efficace du NTSR3 ou l'apparition à la membrane d'un pool de récepteurs dit de réserve. Nous avons également observé un transfert de la NT iodée de la forme membranaire du NTSR3 (hautement glycosylée) vers une forme de plus bas poids moléculaire correspondant à des récepteurs intracellulaires. Il serait par conséquent intéressant de pouvoir localiser précisément le compartiment subcellulaire où se produit ce transfert dans les cellules HT29. Ce mécanisme de transfert du NTSR3 entre les différents compartiments intracellulaires est, comme nous l'avons décrit précédemment (Troisième partie), analogue à celui observé pour la furine. L'intervention de la protéine intracytoplasmique PACS-1 qui se lie au groupement acide phosphorylé présent dans l'extrémité intracytoplasmique de la furine et du NTSR3 a-t-il un rôle dans la localisation subcellulaire et dans le trafic intracellulaire du NTSR3 ?

D'autres points fondamentaux nécessitent d'être approfondis. En effet, nous avons montré que la neurotensine se retrouvait rapidement du milieu extracellulaire au compartiment nucléaire. Quel rôle joue la neurotensine au niveau du noyau des cellules HT29 ? Est-elle dégradée ? Le NTSR3 est-il responsable de ce transport ? La forme nucléaire du NTSR3 est-elle identique à la forme membranaire ou subit-il un quelconque clivage ? Provient-il de la surface cellulaire ? Existe-t-il un autre récepteur pour la neurotensine au niveau nucléaire ? Quelle est la fonction du NTSR3 dans le noyau ?

Toutes ces questions restent encore sans réponse et il est certain que la compréhension de ces mécanismes sera bénéfique pour l'élucidation du rôle de facteur trophique décrit pour la neurotensine.

- Au niveau de la dimérisation entre le NTSR3 et le NTSR1 : Le NTSR1 et le NTSR3 sont en partie retrouvés sous forme d'hétérodimères au niveau de la surface des cellules HT29 quiescentes. Il ne semble pas que l'application de neurotensine exogène modifie cet état de dimérisation mais il serait néanmoins intéressant de définir la stœchiométrie du complexe vis-à-vis du peptide mais aussi à l'intérieur du complexe, entre le NTSR1 et le NTSR3. De la même manière, il serait important de localiser les motifs impliqués dans cette interaction. On pourrait alors, en utilisant des peptides correspondant à ces motifs en interaction, montrer l'effet du processus d'hétérodimérisation, à la fois sur la croissance des cellules HT29 induite par la neurotensine et sur la capacité de ce peptide à induire des tumeurs après inoculation des cellules HT29 dans des souris nude. Ces travaux permettraient de mettre en évidence le rôle de la dimérisation, si rôle il y a, dans les processus tumoraux induits par la neurotensine. Il serait également intéressant d'étudier les effets des autres ligands extracellulaires du NTSR3 sur la dimérisation NTSR1-NTSR3.

Une autre question importante concernant ce système cellulaire est également à ne pas négliger. La liaison de la NT au NTSR3 entraîne-t-elle, tout comme dans les cellules microgliales, l'activation de la voie des MAP kinases ? Pour répondre à cette question, nous nous proposons de bloquer sélectivement la synthèse du NTSR3 ou du NTSR1 dans les cellules HT29 en utilisant des oligonucléotides antisens des ARNm codant pour ces récepteurs. Ces travaux permettront sans doute de révéler si le complexe NT-NTSR3 peut seul activer les protéines de la voie des MAP kinases.

Au niveau de la fonction physiologique du NTSR3 chez la souris :
Au laboratoire, nous disposons de souris invalidées pour le NTSR3 (souris gracieusement fournies par les Dr. Thomas Willnow et Anders Nykjaer, Hambourg, Allemagne) et des résultats comportementaux préliminaires, obtenus par le Dr. Isabelle Dubuc à Rouen, semblent indiquer que ce type de récepteur de la neurotensine serait impliqué dans les processus de résignation chez la souris. En effet, les souris invalidées pour le NTSR3 sont moins résignées face à un effort. Ainsi, les souris invalidées pour le NTSR3 répondent deux à trois fois plus rapidement dans les tests comportementaux comme l'épreuve de la suspension par la queue ou de la nage forcée, par rapport aux souris sauvages. De plus, des résultats préliminaires obtenus par le Dr. Jean Mazella au laboratoire indiquent que la capacité fixatrice maximale du NTSR2 au niveau cérébral est nettement diminuée (50 %) chez les souris invalidées pour le NTSR3 par rapport à celle mesurée chez les souris sauvages. Ces résultats, bien que préliminaires, laissent entrevoir de possibles relations entre l'expression du NTSR3 et celle du NTSR2 chez la souris. Il serait par conséquent intéressant d'étudier et de comparer les réponses analgésiques provoquées par la neurotensine à la fois chez les souris invalidées pour le NTSR3 et chez les souris sauvages.

Ces différents travaux, comme nous avons pu l'observer tout au long de ce manuscrit, apportent un début de réponse quant à la (ou les) fonction(s) du NTSR3 au niveau cellulaire et permettent par ailleurs de formuler des hypothèses de travail qui pourront certainement à terme permettre d'élucider les mécanismes moléculaires par lesquels la neurotensine produit ses effets physiologiques.