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La mucoviscidose.

Auteur : Dr. Valérie CHAPPE

McGill University, McIntyre Medical Sciences Building, Dept. of Physiology, Montréal, Québec, Canada.

Troisième partie - Le canal CFTR :

II - Les multiples fonctions du canal CFTR


1 - Les propriétés du canal
1.1 - conductance et sélectivité
En déterminant la relation courant-voltage (I/V), pour un canal unitaire dans un milieu symétrique (même composition ionique de part et d’autre de la membrane), on obtient une droite dont la pente est la conductance unitaire (g). On peut également par cette relation définir le potentiel d’inversion du courant (Erev) pour lequel le flux des ions est nul. Les mesures de conductance d’un canal, et sa séquence de perméabilité donnent des informations sur les propriétés du canal. En effet, les intéractions entre les ions perméants et le pore du canal dépendent de leurs propriétés physiques et de leurs structures respectives. CFTR forme un canal anionique permettant la diffusion passive des ions chlorure. La portion extra-cellulaire du canal ne présente pas de sélectivité anionique et le site précis ainsi que le mécanisme de sélectivité de charge sont inconnus (Dawson et al., 1999).

CFTR est hautement sélectif pour les anions plutôt que pour les cations monovalents, bien que cette sélectivité soit imparfaite : le Cl- est 10 à 20 fois plus perméant que Na+ (Anderson et al., 1991b; Bear et al., 1991). Les ions qui sont facilement déshydratés tendent à être plus perméants que les ions qui retiennent plus fortement l'eau d'hydratation .

Les boucles intracytoplasmiques qui relient les segments transmembranaires impliqués dans la formation du pore, ne participent pas directement aux mouvements des ions. À l’inverse, les résidus de la boucle extra-cellulaire 1, influencent la sélectivité du canal (Seibert et al., 1997).

La partie du pore la plus resserrée a un diamètre d'environ 5,3 Å (Hanrahan et al., 1998). La conductance du canal varie entre 6 et 11pS en fonction du type cellulaire, de la température, et de la concentration des ions.

La séquence de perméabilité du canal CFTR est : Br- >Cl- >I- >F-. Cette séquence distingue CFTR des autres canaux chlorure épithéliaux, dans lesquels la perméabilité de l'iodure est plus importante que celle du chlorure (Sheppard et Welsh, 1999). Cependant, dans les domaines transmembranaires la mutation de résidus basiques en résidus acides, modifie la séquence de perméabilité, transformant CFTR d'un canal de faible, en un canal de forte perméabilité à l'iodure, avec une nouvelle séquence : I- >Br- > Cl- > F-. Ce qui correspond à la séquence proposée par J.A. Tabcharani et collaborateurs (1997). Les recherches menées par P. Linsdell et collaborateurs, montrent que des ions différents peuvent passer en même temps à travers le pore (Linsdell et al., 1997a). Le résidu R347, dans le segment transmembranaire 5, sert vraisemblablement de filtre de sélectivité anionique. Il intervient dans le transport multi-anionique en formant des intéractions de charge (Tabcharani et al., 1993; Wigley et al., 1998). Des mutations du résidu T338, dans le segment transmembranaire M6, altèrent l'intéraction entre l'ion perméant et le pore du canal. Les thréonines T338 et T339 procurent une stabilité de structure à l'hélice a 6 grâce à des ponts hydrogènes intra-hélice (Linsdell et al., 1998c).

2 - Régulation des mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal CFTR.
La durée d'ouverture du canal est variable en fonction de la température et du modèle cellulaire considéré. Ceci représente certainement les différences d’expression des isoenzymes pouvant réguler CFTR dans une cellule donnée. Pour des températures physiologiques (35°C) la durée d'ouverture du canal CFTR est comprise entre 100 et 250 ms. Les mécanismes qui contrôlent l’ouverture et la fermeture sont des événements séquentiels, impliquant des étapes de phosphorylation suivies de la liaison et l’hydrolyse du MgATP. Le modèle de base sur lequel les études structure-fonction s’appuient propose que des changements de conformation du domaine R, après phosphorylation, permettent le passage des ions chlorure. La levée de l'inhibition imposée par l'état déphosphorylé du domaine R stimule l'interaction entre l'ATP et les domaines NBD.

On distingue deux étapes dans l’ouverture du canal :
1 - La phosphorylation du domaine R. Son degré de phosphorylation détermine la probabilité d’ouverture. Bien que les résidus phosphorylables du domaine R soient connus, les résidus impliqués dans les mécanismes d’ouverture et de fermeture du canal sont incertains (Hwang et al., 1993; Hwang et al., 1994).

2 - La liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les sites NBD. Elle entraîne une modification conformationnelle des domaines transmembranaires du canal CFTR. L’hydrolyse des nucléotides triphosphates est indispensable à l’ouverture du canal, et la phosphorylation préalable par la PKA augmente cette réaction. Le canal déphosphorylé est incapable d'hydrolyser l'ATP. Sur des membranes excisées, après phosphorylation par les PKA, le canal peut être ouvert par les nucléotides triphosphates mais pas par les analogues non hydrolysables de l’ATP, l'ADP ni l’AMPc (Schultz et al., 1995).

L'hydrolyse de l'ATP représente l’étape limitante à la fois pour l’ouverture et la fermeture du canal. Ces deux événements interviennent sur des sites différents d'une même molécule. Le domaine NBD1 est le site d’hydrolyse de l'ATP couplé à l'ouverture du canal et le domaine NBD2 est le site d’hydrolyse de l'ATP permettant la fermeture du canal. Dans des expériences de protéine de fusion, les activités ATPasiques ont été localisées sur les résidus 433-589 pour le domaine NBD1, et 1208-1399 pour le domaine NBD2 (Seibert et al., 1997; Mathews et al., 1998). L’hydrolyse de l'ATP sur les domaines NBD du canal CFTR est plus lente que celle des autres ATPases. Cette vitesse de réaction correspond d’avantage à celle de l'hydrolyse du GTP au niveau des sous-unités a des protéines G. En 1995, MR Carson et MJ Welsh ont comparé les domaines NBD du canal CFTR aux sous-unités a des protéines G. Sur le plan structural, le motif C spécifique des transporteurs ABC ressemble fortement au site catalytique des GTPases (motif D-X-[G/A]-G-Q). De plus, la liaison et l’hydrolyse de l’ATP sur les domaines NBD du canal CFTR contrôlent la durée d’ouverture et de fermeture du canal, de même que la liaison et l’hydrolyse du GTP contrôlent la durée d’activation des protéines G (Gadsby et Nairin, 1999; Foskett et al., 1998).

2.1 - Phosphorylation par les PKA et les PKC
La première étape de l’activation du canal passe par une phosphorylation par les PKA. In vitro (canal isolé), on trouve cinq résidus serines, phosphorylés par la PKA, situés dans le domaine R: 660, 700, 737, 795, et 813. Il existe probablement sur ce domaine d'autres résidus pouvant être phosphorylés par les PKA in vivo (dans les cellules intactes). La phosphorylation sur le domaine R se produit avec une stœchiométrie de 5 à 6 mol/mol après une exposition limitée à la PKA. Les cinétiques de phosphorylation sont influencées par la structure locale de la protéine CFTR, ainsi que par la proximité et l'activité sélective des phosphatases endogènes de la cellule. Sur un canal isolé, la PKC phosphoryle le domaine R avec une stœchiométrie de 2 mol/mol, essentiellement sur les résidus sérines 686-790. Et dans les cellules CHO et Calu-3, la PKCe, régule CFTR (Liedtke et Cole, 1998). La phosphorylation du canal CFTR par les PKC semble stimuler une phosphorylation ultérieure par la PKA (Yurko-mauro et al., 1998) puisque l'inhibition de la phosphorylation par les PKC prévient une phosphorylation ultérieure du canal CFTR par la PKA. Ces données suggèrent qu'une phosphorylation de base par les PKA et les PKC soit nécessaire pour entraîner l'activation du canal, en agissant sur des sites de phosphorylation essentiels ou que les PKC activent CFTR indirectement par des phosphorylations au niveau du cytosquelette ou des vésicules de transport.

2.2 - Régulation du canal CFTR par les protéines phosphatases
Très rapidement, après phosphorylation par les PKA, la déphosphorylation par des protéines phosphatases inactive le canal. A l’inverse, l’inhibition des protéines phosphatases endogènes, augmente l'efficacité de stimulation du canal CFTR et ralentit son retour à l'état désactivé. Mais peu de choses sont connues sur la spécificité avec laquelle ces différentes phosphatases déphosphorylent les phosphosérines du canal CFTR
Chez les eucaryotes, les quatre principaux types de protéines phosphatases sérine/thréonine solubles sont codés par les membres de deux familles de gènes. Les protéines phosphatases PP1, PP2A, et PP2B appartiennent à la famille des PPP, dont la spécificité de substrat est modulée par différentes sous-unités régulatrices. PP2C appartient à la famille PPM de protéines phosphatases dépendantes du magnésium et qui ne possèdent pas de domaine de régulation. Les phosphatases PP2A et PP2C sont critiques pour la régulation du canal CFTR. Ces enzymes comportent des motifs d'ancrage à la membrane, permettant la co-localisation avec CFTR (Becq et al., 1993). La protéine PP2A provoque une déphosphorylation quasi complète du canal CFTR et les phosphatases endogènes PP2C sont des régulateurs puissants de l'activité du canal CFTR. Leurs effets sur l'ouverture et la fermeture du canal unitaire sont distincts de ceux de la PP2A, mais similaires à ceux des phosphatases endogènes dans les cellules CHO, BHK, et T84. L’association de plusieurs phosphatases est nécessaire pour la désactivation complète du canal CFTR (Luo et al., 1998). Le canal CFTR excisé à partir de cellules CHO ou de cellules respiratoires humaines, est désactivé par l’action de phosphatases associées à la membrane. Il est activée par des inhibiteurs de phosphatages (Becq, et al., 1994). Cette régulation a également été montrée dans le cas de certaines mutations comme R117H, G551D et dF508.

2.3 - Régulation par l’ATP
Une fois phosphorylé, l'ouverture du canal nécessite de l'ATP cytosolique et du magnésium. En absence d’ATP, le canal CFTR phosphorylé se ferme. L’ADP et les analogues non-hydrolysables de l’ATP inhibent l’activation par l’ATP, de manière compétitive, par interaction spécifique sur le domaine NBD2 (Riordan, 1993). Bien que, l’AMP-PNP ne puisse pas ouvrir le canal CFTR phosphorylé, une fois le canal ouvert il peut s’y lier fortement et le bloquer dans cette conformation pour quelques minutes. La liaison de l’AMP-PNP se produit probablement au niveau de l’extrémité C-terminale du domaine NBD (Gadsby et al., 1998). Bien que, la probabilité d'ouverture du canal augmente en fonction de la concentration en ATP intracellulaire, c’est le rapport entre ATP et ADP qui est le plus important dans la régulation du canal CFTR. Des changements dans l'état métabolique de la cellule qui modifient ce ratio régulent l'activité du canal (Welsh et Anderson, 1993).

3 - Régulation par les seconds messagers
L'activation du canal CFTR par la protéine kinase A est stimulée par l'AMPc. Le niveau d'AMPc est contrôlé par la balance entre sa synthèse par les adénylate-cyclases et son hydrolyse par les phosphodiestérases. Dans les cellules provenant d'épithéliums respiratoires, l'activité du canal CFTR sauvage est particulièrement sensible à l'activité de la phosphodiestérase de type III. L'inhibition de ce type de phosphodiestérase élève considérablement le niveau d'AMPc intracellulaire, entraînant une augmentation importante de l'efflux de chlorure (Kelley et al., 1995).
Il est également possible d’activer le canal CFTR par des mécanismes indépendants de l’AMPc. Une étude menée dans des cellules provenant de carcinomes mammaires de souris C127i, transfectées avec le gène codant pour le canal CFTR humain, a montré que l’ATP extra-cellulaire peut activer le transport de chlorure. La stimulation du canal CFTR par des analogues de l'ATP suggère une stimulation impliquant les récepteurs P2 purinergiques (Cantiello et al., 1994). Dans des cellules CFPAC transfectées avec le gène codant pour la protéine CFTR sauvage, il a été noté que le transport de chlorure est régulé par le récepteur P2y2, ainsi qu’une implication des récepteurs adénosine. Cependant, ces résultats ne peuvent pas exclure la possibilité d'une interaction directe de l'adénosine sur CFTR (O’Reilly et al, 1998).

4 - CFTR et transport d'ATP : divergences sur le thème <BR> Ces dernières années une nouvelle hypothèse sur une des multiples fonctions attribuées à la protéine CFTR a été émise par les chercheurs des groupes de HF Cantiello, JF Engelhardt et WB Guggino, selon laquelle le canal CFTR serait perméant à l’ATP. Les observations montrent que les cellules qui expriment de manière endogène ou après transfection le canal CFTR (les cellules mammaires C127i, pulmonaires Calu-3, pancréatiques CFPAC, ou encore intestinales T84 et Caco-2) sécrètent de l’ATP après activation de la voie de signalisation de l’AMPc. Dans le cas de la mutation dF508, ils ne constatent plus de sortie d’ATP stimulée par l'AMP cyclique. Le rôle physiologique attribué au transport d’ATP par CFTR est la régulation du pH intracellulaire et la libération d’acide arachidonique après activation de la voie de signalisation des récepteurs P2 purinergiques. Ces récepteurs de haute affinité à l’ATP sont exprimés dans de nombreux épithéliums et notamment dans ceux exprimant le canal CFTR (Cantiello et al., 1997).

A l’inverse, un grand nombre de laboratoires montrent qu’indépendamment d’une sécrétion cellulaire d’ATP, il n’y a pas de conductance ATP dépendante de l’AMPc à travers le canal CFTR. La différence de sécrétion d'ATP en fonction de la présence ou de l’absence du canal CFTR dans les épithéliums, est provoquée par des stimulations mécaniques des cellules indépendamment du canal CFTR (Grygorczyk et Hanrahan, 1997; Watt et al., 1998). Par ailleurs, sur des cellules issues de systèmes épithéliaux non respiratoires, on ne retrouve pas de conductance unitaire ou macroscopique de l'ATP associée à CFTR. Enfin, des études sur des canaux CFTR incorporés dans des bicouches lipidiques (bilayer) montrent que ce canal ne transporte pas l'ATP (Li et al., 1996b).

L’ensemble de ces résultats montrent que les mécanismes ou les régulations de la sécrétion ou du transport d'ATP, sont certainement très différents en fonction du type d'épithélium étudié. Une hypothèse avancée pour expliquer ces divergences est qu’un canal présent dans les solutions purifiées du canal CFTR, fonctionne comme une protéine transportant l'ATP. Deux possibilités sont alors avancées : 1°) un autre canal conduisant l'ATP de manière spécifique serait associé à CFTR dans ces vésicules, 2°) CFTR nécessiterait un signal additionnel ou des régulateurs qui permettraient le transport d'ATP (Schwiebert et al., 1999). Dans ce sens des études menées sur les cellules MDCK, démontrent la présence d'un canal ATP concomitant avec la présence du canal CFTR (Sujita et al., 1998).

5 - Les autres types de perméabilités
La complexité des mécanismes de régulation du canal CFTR et l’importance des dysfonctionnements observés dans les épithéliums de phénotypes CF, font émerger des hypothèses mettant en cause d’autres fonctions pour CFTR que le seul transport de chlorure.
La perméabilité d’anions polyatomiques de taille connue, a été étudiée dans les cellules CHO transfectées de manière stable avec le gène CF humain codant pour le canal CFTR sauvage. Les anions polyatomiques testés du côté externe, donnent la séquence de perméabilité suivante NO3- > Cl - >HCO3-> formate> acétate. A l’inverse, le pyruvate, le propanoate, le méthane sulfonate, l'éthane sulfonate, et le gluconate ne sont pas perméants, quel que soit le côté de la membrane duquel ils sont testés. La perméabilité dépend de l'énergie d'hydratation des ions (Linsdell et al., 1997b).
Le canal CFTR est également perméant au tripeptide glutathion : g-glutamyl-cystéinyl-glycine (GSH), qui représente l’antioxydant extra-cellulaire le plus abondant dans les poumons. Ils contiennent environ 400mM de GSH, ce qui représente cinquante fois la concentration trouvée dans le plasma et 100 fois celle trouvée dans les fluides de beaucoup d'autres tissus. La concentration en GSH dans les épithéliums présentant un phénotype CF est fortement réduite (Linsdell et Hanrahan, 1998a).
Le canal CFTR permet également le passage de manière très asymétrique d'anions organiques de grande taille uniquement lorsqu’ils sont présents du côté intracellulaire. Cette asymétrie n'est pas observée avec des anions plus petits. Les inhibiteurs d'ATPases, qui bloquent le canal en configuration ouverte, détruisent cette asymétrie, permettant l'influx de gros anions. L'hydrolyse de l'ATP est donc nécessaire au maintien de l’asymétrie (Linsdell et Hanrahan, 1998b).
Le transport de GSH et l'efflux d'anions organiques de grande taille représentent de nouvelles fonctions physiologiques pour le canal CFTR.

6 - CFTR régulateur de la conductance membranaire
Avant qu’on ne lui reconnaisse des fonctions de canal chlorure, on attribuait surtout à CFTR des propriétés de régulation de la conductance membranaire (Stutts et al., 1997; Egan et al., 1995).

6.1 - Régulation du canal ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel)
L’ORCC est un canal chlorure régulé par l'AMPc dont on a longtemps pensé qu’il pouvait être la protéine, impliquée dans la régulation de la conductance membranaire, déficiente dans la mucoviscidose. Les études d’interactions entre CFTR et d’autres canaux ioniques membranaires montrent que la présence du canal CFTR fonctionnel est indispensable à l'activation du canal ORCC par les PKA. Dans les systèmes de membranes artificielles, CFTR régule le canal ORCC par des interactions membranaires ou cytoplasmiques (Scwiebert et al., 1999). EM Schwiebert et collaborateurs, proposent également que l’intéraction entre CFTR et le canal ORCC dans les cellules épithéliales, soit liée à un mécanisme autocrine/paracrine impliquant l'ATP. Nous avons démontré que l'expression du canal CFTR dans des cellules d’insectes de type Hi-5, confère au canal ORCC endogène une sensibilité à la glibenclamide, qui est un inhibiteur spécifique du canal CFTR (Julien et al., 1999).

6.2 - Régulation du canal sodium épithélial (ENaC):
L’absorption accrue de sodium, dans les épithéliums respiratoires CF, montre un contrôle négatif du canal sodium épithélial sensible à l’amiloride par CFTR (Mall et al., 1998).
Des études récentes montrent que les domaines NBD1 et R du canal CFTR interagissent directement avec la partie C-terminal du canal ENaC exprimé chez la levure, ou dans des fibroblastes transfectés de manière stable avec ces deux canaux.

Plusieurs possibilités sont avancées pour expliquer la régulation négative du canal ENaC par CFTR :
1 - les transporteurs de la famille ABC, de type MDR (Multi Drug Resistance), peuvent transporter des substrats comme les phospholipides à travers les membranes. Donc des messagers phospholipidiques, pourraient jouer un rôle dans la modulation du canal ENaC par CFTR;

2 - cela serait directement le résultat de l’interaction entre CFTR et certaines sous-unités du canal ENaC.

3 - CFTR et le canal ENaC pourraient interagir grâce à des éléments du cytosquelette associés à la membrane. Cette interaction serait impliquée dans la capacité du canal CFTR à interférer avec la régulation par la PKA du canal ENaC. Ces 2 canaux peuvent être affectés par des interactions avec le cytosquelette, notamment le cytosquelette d'actine.

6.3 - Régulation des canaux potassium (K)
CFTR est non seulement capable de réguler directement, ou indirectement d'autres canaux ioniques, mais aussi de transférer des effets modulateurs d’agonistes et d'antagonistes sur d'autres protéines.
Les sulfonylurés, sont des inhibiteurs de canaux K sensibles à l'ATP. Or, le composé sulfonyluré glibenclamide inhibe l'activité du canal CFTR, ce qui suggère un lien entre CFTR et la famille des canaux K sensibles à l’ATP. Les canaux K sont exprimés dans beaucoup de tissus. La sensibilité aux sulfonylurés des canaux K pancréatiques, est conférée par la protéine SUR, une protéine de liaison aux sulfonylurés, membre de la famille des transporteurs ABC, et les sulfonylurés tels que la glibenclamide et le tolbutamide sont utilisés contre le diabète. La protéine SUR, est une molécule de 140 kDa, qui a les caractéristiques pharmacologiques d'un récepteur de haute affinité. Contrairement au canal CFTR qui cumule à la fois des fonctions de transport de chlorure et de régulateur de la conductance membranaire, la protéine SUR exprimée seule, ne montre pas d'activité canalaire, suggérant qu'elle se comporte seulement comme un régulateur des canaux ioniques.

Les canaux K sensibles à l'ATP, sont un sous-groupe de la superfamille des canaux K rectifiants entrants (KIR). Les canaux KIR ont été identifiés sur la membrane basolatérale des cellules des épithéliums respiratoires, où ils interviennent dans le recyclage du potassium. Dans les cellules CFPAC, on a montré que la présence du canal CFTR, influence l’activation par l’AMPc des canaux potassium épithéliaux (Loussouarn et al., 1996). Il a récemment été suggéré que des canaux K similaires existent sur la membrane apicale des cellules épithéliales des voies respiratoires. Un membre de cette famille a été identifié dans le poumon: ROMK1. La famille des canaux ROMK est constituée de plusieurs isoformes de canaux K sensibles à l'ATP. Le canal ROMK2 présente une sensibilité faible et très variable aux composés sulfonylurés tels que la glibenclamide. Par leur co-localisation dans le canal collecteur du rein, il est possible que le canal CFTR régule l'activité du canal ROMK2.

CFTR pourrait êt re couplé avec ROMK1 ou ROMK2, dans la membrane cellulaire, procurant un domaine manquant à ces canaux et, restaurant ainsi une sensibilité aux sulfonylurés. Les mécanismes qui contrôlent les interactions entre CFTR et ROMK2 pourraient impliquer une protéine de régulation ou des éléments du cytosquelette.

La phosphorylation atténue la réponse aux sulfonylurés et altère les interactions entre CFTR et ROMK2. De la même manière que pour les interactions entre CFTR et les canaux ORCC ou ENaC, l’interaction entre CFTR et ROMK2 nécessite la présence du domaine NBD1 du canal CFTR fonctionnel (McNicholas et al., 1996). Des études récentes suggèrent la possibilité d'un complexe formé entre le canal CFTR et le canal ROMK1 (Ho et al., 1998).
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